Viral Encephalopathy and Retinopathy (VER) caused by Betanodavirus in Mediterranean sea fish: experience of Istituto Zooprofilattico Sperimentale of Sicily.

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1 Viral Encephalopathy and Retinopathy (VER) caused by Betanodavirus in Mediterranean sea fish: experience of Istituto Zooprofilattico Sperimentale of Sicily Dr.ssa Annalisa Guercio

2 Virus dell’Encefalopatia e Retinopatia Virale (VER) Responsabile di elevata mortalità in specie ittiche marine di allevamento e selvatiche Sintomatologia nervosa Diminuzione del valore economico del prodotto Il branzino (Dicentrarchus labrax) è la specie maggiormente colpita Trasmissione tra specie ittiche di allevamento e specie selvatiche Profilassi indiretta unico strumento disponibile per prevenire l’introduzione della malattia in aree endemiche

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4 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals – O.I.E. UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005

5 Encefalopatia Retinopatia Virale (VER)  Famiglia: Nodaviridae  Genere: Betanodavirus ssRNA + RNA1: RNA-polimerasi RNA2: 42 kDa capside icosaedrica, 25-30 nm no envelope

6 Diagnosi diretta » Isolamento su colture cellulari SSN-1 da cervello, pool avannotti, midollo spinale, occhio » RT-PCR Dal 2004 al 2015 sono state effettuate 1591 analisi per Betanodavirus

7 Campioni: cervello, pool avannotti, midollo spinale, occhio Preparazione dell’estratto mediante omogenizzazione in terreno Leibovitz’s (L-15) antibiotato 10X Preparazione del campione

8 Isolamento ed identificazione del Betanodavirus in colture di cellule SSN-1 estratto ↓ Infezione su colture cellulari ↓ 3 passaggi ciechi ↓ Identificazione virale IFD, RT-PCR

9 Monostrato confluente di SSN-1

10 Effetto citopatico da Nodavirus IPV-IBP IBR

11 FORMA SUBCLINICA One Step RT-PCR Estrazione dell’RNA mediante l’uso di colonnine High Pure Isolation kit (Roche) Reazione di Retrotrascrizione-Amplificazione dell’RNA One Step RT-PCR realizzata con l’uso di una coppia di primers specifici per un frammento di 427 bp interno alla regione T4 del gene RNA2 che codifica per la proteina capsidica di 42 KDa PRIMERSSEQUENZA OIE-F25’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT- OIE-R35’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-

12 Risultati: isolamenti di Betanodavirus su colture di cellule SSN-1 da encefali di pesce eseguiti dal 2004 al 2015 ANNO ESAMI ESEGUITI NEGATIVIPOSITIVI/SPECIE ITTICHE SPECIE ITTICA SELVATICA/ALLEVATA 200453 1.Pagellus erythrinus 2.Trisopterus minutus capellanus selvatica 2005369307 50 Gobius niger 5 Sardina pilchardus 6 Mullus barbatus 1 Trachiurus trachiurus selvatica 200697 0 200799 0 200897 0 20091138 Epinephelus marginatusselvatica 2010--- 2011--- 2012--- 2013101 Epinephelus aeneusselvatica 2014574 2 Epinephelus marginatus 51 Dicentrarchus labrax selvatica allevata 2015--- TOT736610126

13 Risultati: RT-PCR per Betanodavirus eseguite su encefali di pesce dal 2005 al 2015 ANNOESAMI ESEGUITIPOSITIVINEGATIVI 2005 16523142 2006580 20071510 20082252223 200952844 2010150 2011505 2012303 20131020 201458535 2015210 TOT85586769

14 Specie ittiche risultate positive al Betanodavirus Epinephelus marginatus Dicentrarchus labrax Sardina pilchardus Trachiurus trachiurus Pagellus erythrinus Epinephelus aeneus Gobius niger Mullus barbatus Trisopterus minutus

15 L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia dispone di oltre 55 ceppi di Betanodavirus attualmente crioconservati in azoto liquido

16 Risultati: RT-PCR per Betanodavirus eseguite su molluschi e acque dal 2004 al 2015 ANNOCAMPIONE NUMERO ESAMI ESEGUITI NUMERO DI POSITIVI NUMERO DI NEGATIVI 2006MOLLUSCHI120 2007MOLLUSCHI110 2008MOLLUSCHI240 ACQUE202 2009MOLLUSCHI909 2010MOLLUSCHI220 2011MOLLUSCHI606 2012MOLLUSCHI505 TOTALE910

17 Specie bentoniche stanziali potrebbero costituire un serbatoio nel quale il virus può sopravvivere per lunghi periodi Specie pelagiche potrebbero rivestire un più significativo ruolo epidemiologico essendo capaci di spostarsi anche ad ampie distanze Difficoltà di poter applicare in ambienti aperti, come quello marino, rigide misure di igiene e profilassi Non sono a tutt’oggi disponibili validi vaccini commerciali La vasta diffusione del patogeno rende indispensabile un approfondimento sulle correlazioni epidemiologiche esistenti fra infezione nelle specie allevate ed in quelle selvatiche per gli stretti contatti fra i due ambienti e lo sviluppo di un vaccino Conclusioni

18 GRAZIE PER L’ATTENZIONE