Metanogenesi E’ la reazione di formazione del metano ad opera di microorganismi (phylum Euryarchaeota – per lo più mesofili).  E’ una forma di respirazione.

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1 Metanogenesi E’ la reazione di formazione del metano ad opera di microorganismi (phylum Euryarchaeota – per lo più mesofili).  E’ una forma di respirazione anaerobica in cui accettore di elettroni è il carbonio di composti a basso peso molecolare, quali CO2, HCOOH, CH3OH. Quasi esclusivamente C1 o cmq acidi carbossilici con gruppo metile (CH3COOH, CH3COCOOH) La reazione avviene solo in assenza di O2 (è tossico per i metanogeni), in ambienti dove si ha decadimento della materia organica: sedimenti anossici: paludi, acquitrini, sedimenti lacustri, risaie, … zone umide di discarica tratto digestivo di animali: rumine, intestino cieco (cavalli, conigli, …) o crasso (uomini, cani, …), intestino superiore di insetti cellulolitici (p.es. termiti) sorgenti geotermali di H2 e CO2. impianti di biodegradazione: digestori a fanghi attivi

2 Produzione di metano nel rumine

3 Gli Archaea e i metanogeni
Ci sono 3 tipi di Archaea Crenarchaeota (Estremofili (termofili e psicrofili), acidofili) Euryarchaeota (metanogeni e alofili) Korarchaeota (nessun organismo isolato) Metanogeni: sono anaerobiotici obbligati Methanococcus jannischii was originally isolated from a sample taken from an oceanic depth of 2,600 meters on the East Pacific Rise. It can be grown in a mineral medium containing only H2 and CO2 as sources of energy and carbon for growth within a temperature range of 50 to 86 degrees. Cells are irregular cocci that are motile due to two bundles of polar flagella inserted near the same cellular pole. Its genome has been sequenced completely.

4 GLI ARCHAEA METANOGENI
ORDINE: METHANOBACTERIALES Famiglia: Methanobacteriaceae Genere:Methanobacterium Genere: Methanobrevibacter H2/CO2 Genere: Methanosphaera formiato Famiglia: Methanothermaceae Genere: Methanothermus ORDINE: METHANOCOCCALES Famiglia: Methanococcaceae Genere: Methanococcus H2/CO2 ORDINE: METHANOMICROBIALES Famiglia: Methanomicrobiaceae Genere: Methanomicrobium Genere: Methanogenium H2/CO2 Genere: Methanoculleus Genere: Methanospirillum Famiglia: Methanocorpusculaceae Genere: Methanocorpusculum H2/CO2 Famiglia: Methanoplanaceae Genere: Methanoplanus H2/CO2 Famiglia: Methanosarcinaceae Genere: Methanosarcina acetato H2/CO2 Genere: Methanococcoides Genere: Methanolobus methanolo Genere: Methanohalophilus Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato LE REAZIONI 4H2 + HCO3- + H CH4 + 3H2O CH3OH + H CH4 + H2O CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- Acetotrofia

5 CO2 reduction Acetate fermentation

6  Fermentazione = è la degradazione anaerobica di
Metanogenesi Rappresenta il passaggio finale della decomposizione della materia organica. Durante tale decadimento accettori di elettroni come come O2, SO4 2-, NO3-, Mn(VI), Fe(III) vengono eliminati mentre si accumulano H2 e CO2. In queste condizioni avvengono Fermentazione Metanogenesi  Fermentazione = è la degradazione anaerobica di composti organici come nutrienti (es glucosio) per ottenere composti organici più piccoli (es. lattato, acido acetico, etanolo) senza ossidazione. Metanogenesi = rimuove i prodotti finali di questo decadimento e permette di convertire rifiuti organici in “biogas”

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8 Acetate fermentation CO2 reduction

9  CH4 prodotto/anno da batteri metanogenici = 109 tonnellate.
Metà è utilizzato dai batteri metanotrofici, metà va nell’atmosfera (effetto serra). La biotrasformazione impiega cofattori che trasportano un atomo di C Metanofurano Tetraidro-metanopterina Coenzima M CoM-SH è unico per i metanogeni, gli altri sono presenti anche in altri Archaea

10 formil-MFR formil-H4MPT metenil-H4MPT metilene-H4MPT metil-H4MPT metil-S-CoM

11 Ruolo fisiologico delle idrogenasi
L’attività dei batteri metanogenici è collegata al metabolismo di H2. La reazione di ossidazione di H2 produce e- e H+ sul lato esterno delle membrane. Gli elettroni attraversano la membrana e vengono utilizzati per la riduzione di HCO3- a CH4. A questa reazione è associata la sintesi di ATP. E’ presente una ADP/ATP translocasi che trasferisce ADP all’interno della membrana esterno membrana interno 4 H2 HCO H+ 8 e- 8 H+ CH4 + 3 H2O ATPasi ADP + Pi 2 H+ ATP

12 Formil-metanofurano deidrogenasi
L’enzima (FDH) catalizza la riduzione di CO2 + MFR a N-formilmetano furano. Contiene Mo, un molibdopterina dinucleotide e cluster Fe-S Il coinvolgimento nella reazione del MFR rende lo step unico, tuttavia il meccanismo non lo è: sia Mo che Mo-pterina sono presenti anche in altri enzimi simili (xantina ossidasi che catalizza ox. di xantina ad acido urico). Methanobacterium wolfei contiene 2 FDH (I e II). FDHI predomina in cellule che crescono in presenza di Mo, FDH II in cellule che crescono in presenza di W. W-enzimi sono presenti anche in altri batteri anaerobici.

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14 Donatori di elettroni nella metanogenesi
F420H2 assomiglia a FMN e a FAD. Trasferisce 2 e- come H- (come NADH)

15 Metil-H4MPT:CoM metiltransferasi
E’ un’enzima di membrana (Mtr) costituito da 8 subunità. Ognuna porta come gruppo prostetico la 5’-idrossibenzimidazolil-cobamide Quando il substrato e’ metanolo/metilammina/metilsolfuro si parte direttamente da qui, ossia dalla formazione di metil-CoM

16 Metil-H4MPT:CoM metiltransferasi
Nella forma super-ridotta come cob(I)amide il cofattore accetta il gruppo metilico dal CH3-H4MPT producendo metil-cob(III)amide. CH3-H4MPT + E:CoB(I) H4MPT + E:CH3-CoB(III) In una seconda reazione il gruppo metilico viene trasferito a HS-CoM rigenerando la forma ridotta (Co(I)) dell’enzima e metil-CoM E:CH3-CoB(III) + HS-CoM CH3-S-CoM + E:CoB(I) Simili traferimenti di metili (ad es. formazione di metionina ad opera di metionina sintasi) avvengono in batteri ed eucarioti, ma utilizzano proteine solubili, con un sola subunità.

17 Zn(II) Zn(II) Zn(II) H O H O CH3 CH3 Co(I) Co(III) Co(I) His136 His136
+HS-CoM CH3 CH3 -CH3S-CoM -H2O Co(I) Co(III) Co(I) His136 His136 His136

18 Metil-CoM riduttasi Catalizza la formazione di CH4 da metil-CoM. Contiene come gruppo prostetico F430, un nichel porfinoide con i 4 N pirrolici che coordinano il Ni. La riduzione dell’etero disolfuro e’ esoenergetica e associata alla sintesi di ATP CoB-SH, metil –S-CoM e F430 sono tipici di archaeobatteri metanogenici. Il Nickel (I) lega il CH3, che viene ridotto e rilasciato come CH4. A differenza di prima, quando col Co si aveva trasferimento e non riduzione.

19 Quando non si parte da CO2 …

20 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile dalla degradazione aerobica C6H12O6 + 6O CO2 + 6H2O (DG°’ = kJ/mole) C6H12O CO2 + 3CH4 (DG°’ = -390 kJ/mole) La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di “SINTROFIA” la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la co-coltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a: Strain S 2CH3CH2OH + 2H2O CH3COO- + 2H+ + 4H2 (DG°’ = +19 kJ per 2 mol of ethanol) Strain M.o.H. 4H2 + CO CH4 + 2H2O (DG°’ = -131 kJ per mol of methane) Co-Culture 2CH3CH2OH + CO CH3COO- + 2H+ + CH4 (DG°’ = -112 kJ per mol of methane)

21 Obligate syntrophy between an acetogen and a methanogen is common
Each species (e.g., a methanogen and an acetogen) requires the other: the acetogen provides the hydrogen; the methanogen prevents a build-up of hydrogen (which inhibits the acetogens)

22 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
Un processo che favorisce la sintrofia è il TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H2, HCOO- E CH3COO- in cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la produzione da parte degli acetogeni sintrofici

23 Glucosio + 4 H2O -> 2 acetato + 2 HCO3- + 4 H+ + 4 H2
Fermentazione Glucosio + 4 H2O -> 2 acetato + 2 HCO H+ + 4 H2 DG=-207 kJ mol-1 // -319 kJ mol-1 2 Etanolo + 2 H2O -> 2 acetato + 2 HCO H+ + 4 H2 DG=+19,4 kJ mol-1 // -37 kJ mol-1 Metanogenesi 4 H2 + HCO3- + H+ -> CH4 + 3 H2O DG=-136 kJ mol-1 // -3,2 kJ mol-1 Acetogenesi 4 H2 + 2 HCO3- + H+ -> acetato + 4 H2O DG=-105 kJ mol-1 // -7,1 kJ mol-1 Sintrofia Condizioni standard // In acqua dolce CH4, 0.6 atm; H2, 10-4 atm

24 What happens to all this methane?
Diffusive transport up into oxic zone – aerobic methane oxidation Bubble ebullition (in shallow seds, with strong temperature or pressure cycles) followed by oxidation in atmosphere Anaerobic methane oxidation coupled to sulfate reduction Gas hydrate formation

25 Degradazione anaerobica del metano in sedimenti marini
SO H2 + H+ -> HS- + 4 H2O DG=-156 kJ mol-1 CH4 + 2 H2O -> CO2 + 4 H2 Inverso della metanogenesi DG=+131 kJ mol-1 Totale: SO42- + CH4 -> HCO3- +HS- + H2O

26 Used fluorescent probes to label, image aggregates of archaea (methanogens, red) and sulfate reducers (green) in sediments from Hydrate Ridge (OR) – observed very tight spatial coupling. Boetius et al., 2000

27 (CH2 O)n Fotosintesi Batteri chemolitotrofi Respirazione Metanotrofi +O2 CH4 CO2 -O2 Metanogeni Batteri fototrofi Respirazione anaerobica Fermentazione (CH2 O)n

28 Low T + high P + adequate gas (methane, trace other HC, CO2) => gas hydrate
Why do we care about methane hydrates? Resource potential Fluid flow on margins Slope destabilization / slope failure Chemosynthetic biological communities Climate impact potential

29 1 m3 hydrate => 184 m3 gas + 0.8 m3 water
DIC = 980 Terr bio = 830 Peat = 500 Atm = 3.5 Mar bio = 3 Total fossil fuel = 5000 x 1015 gC total hydrate = 10,000 x 1015 gC (a guess!)

30 METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI
Reattori a biomassa libera Reattori a biomassa adesa Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia (es. la rimozione dell’H2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H2 tossico per gli acetogeni) Stabilità della biomassa nel reattore (basso “washout” cellulare) Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed) La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam cm) ad alta sedimentabilità Reattori a letto fisso espanso fluidizzato Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte (plastica, legno,ecc.) Strati di microrganismi Materiale di supporto

31 METANOGENESI: I REATTORI UASB
Biogas Effluente Ricircolo Influente MESOFILI TERMOFILI

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34 DGGE: elettoforesi su gel in gradiente denaturante
 The ribosome is the site of translation of messenger RNA into protein. It is composed of two subunits. In prokaryotes, the large subunit is called 50S and the small subunit is called 30S. The 30S subunit consists of a single strand of RNA (the 16S rRNA, 1542 bases), and 21 proteins ranging in molecular weight from 9 kD to 61 kD. The 30S subunit can exist independently from the 50S subunit and be reconstituted from its components in vitro. The 30S subunit is the site of translation initiation. An understanding of its structure is useful for understanding the mechanisms of protein translation, and perhaps for designing drugs to modify these mechanisms. DGGE: elettoforesi su gel in gradiente denaturante

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36 formil-MFR deidrogenasi Fe-S, MPTdinucleotide, Mo
enzima di membrana – diverse subunità rid. 2 e- idrogenasi formil-MFR formil-H4MPT metenil-H4MPT (b-e) enzimi solubili, 1 subunità, senza gruppi prostetici rid. 2 e- idrogenasi metilene-H4MPT rid. 2 e- idrogenasi metil-H4MPT Metil-H4MPT:CoMtransferasi Fe-S, corrinoide, di membrana metil-S-CoM metil-S-CoM reduttasi 3 subunità, F430=nichel tetrapirrolo Eterodisolfuro riduttasi rid. 2 e-