GLI ENZIMI La via per accelerare i processi biologici.

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1 GLI ENZIMI La via per accelerare i processi biologici

2 ENZIMI Sono delle proteine altamente specializzare con attività catalitica, accelerano le reazioni chimiche rimanendo inalterati al termine della reazione stessa. La loro struttura è molto complessa e caratterizzata da una ben precisa configurazione tridimensionale con ripiegamenti, rientranze e sporgenze. Il sito attivo dell’enzima è un regione (estremamente piccola della molecola) a forma di fessura o di tasca che istaura legami con il substrato. E’ costituito da pochi residui di amminoacidi con una configurazione spaziale ben definita, complementare a quella del substrato con cui interagisce. Per l’interazione enzima substrato è stato suggerito il modello chiave serratura:

3 La maggior parte degli enzimi portano nella loro molecola una parte non proteica.
In questo caso l’enzima intero prende il nome di oloenzima, la componente proteica di apoenzima, la non proteica di gruppo prostetico Se il gruppo prostetico è facilmente dissociabile dall’apoenzima esso prende il nome di coenzima. La nomenclatura e la classificazione degli enzimi si basa sul tipo di reazione catalizzata, si hanno così 6 classi di enzimi: All’interno delle classi gli enzimi vengono generalmente classificati in base al nome del substrato specifico

4 Peso molecolare Specificità Potere catalitico
DIFFERENZE TRA ENZIMI E CATALIZZATORI INORGANICI Gli enzimi si distinguono dai comuni catalizzatori inorganici per le seguenti significative caratteristiche: A differenza dei catalizzatori della chimica inorganica che sono composti molto semplici spesso anche semplici atomi, gli enzimi sono molecole proteiche e, pertanto, espressione dei geni. Sono caratterizzati da un peso molecolare molto alto e da una configurazione tridimensionale piuttosto complessa, articolata nelle quattro strutture proprie delle proteine. Peso molecolare Diversamente dai catalizzatori inorganici che molto spesso si comportano da pas-partout e catalizzano numerose reazioni anche molto diverse tra loro, gli enzimi sono altamente specifici sia verso il substrato sul quale agiscono, sia verso il tipo di reazione che catalizzano. La maggior parte di enzimi agisce su di un unico substrato o su un numero molto limitato di composti. Specificità Potere catalitico Gli enzimi accelerano le reazioni almeno di un milione di volte.

5 ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Perché una reazione chimica possa avvenire, si devono rompere i legami preesistenti e si devono eventualmente formare nuovi legami. Consideriamo una popolazione di molecole R-X che devono reagire per formare il prodotto R+ X-. Affinché una reazione chimica avvenga è necessario: • le molecole si urtino • urto efficace, nel senso che le molecole che si urtano devono avere un contenuto energetico tale da permettere loro di formare il complesso attivato (R+--- X -) ad alto contenuto energetico e bassa stabilità. Il livello energetico a cui è localizzato il complesso attivato si chiama stato di transizione. La differenza di energia tra i reagenti e lo stato di transizione viene detta energia di attivazione (Ea). Ea rappresenta quindi una barriera energetica che i reagenti devono superare per trasformarsi nei prodotti.

6 Il tutto può essere simpaticamente rappresentato come un sasso (reagente) che per arrivare a valle (prodotto) deve superare la montagna (Ea) Maggiore è il numero di molecole R-X capaci di formare, nell’unità di tempo, il complesso attivato maggiore sarà la velocità di reazione. La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza consumata o prodotta nell’unità di tempo: v = dc/dT Una reazione chimica può essere accelerata aumentando la temperatura. Infatti aumentando la T aumenta l’energia cinetica delle particelle aumenta il numero degli urti efficaci tra le molecole un maggior numero di particelle, nell’unità di tempo, formerà il complesso attivato.

7 CATALISI ENZIMATICA Un altro modo per accelerare una reazione è quello di aggiungere un enzima (E). E si lega alle molecole R-X per formare il complesso attivato (E-R+---X-) il cui stato di transizione è più basso rispetto a quello della reazione non catalizzata. Così alcune molecole di R-X che prima non erano in grado di reagire, adesso legandosi a E entrano nello stato di transizione (più basso) per formare i prodotti. Gli Enzimi catalizzano tutte le reazioni che avvengono nell’ambiente cellulare dove le condizioni di temperatura e concentrazione esistenti comporterebbero tempi di reazione molto lunghi.

8 Come si misura la velocità di una reazione catalizzata
La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza consumata o prodotta nell’unità di tempo. Un altro modo per esprimere la velocità di una reazione catalizzata è il numero di turnover. Esso indica il numero di molecole di substrato che reagiscono con una sola molecola di enzima nell’unità di tempo. La velocità di reazione cambia da enzima ad enzima ed è caratteristica di ognuno di essi. vo [P] [S] Tempo Concentrazione Andamento nel tempo di una reazione enzimatica misurata come comparsa del prodotto (P) o scomparsa del substrato (S). La linea tratteggiata tangente alla curva rappresenta la velocità iniziale v0 All’inizio quando è praticamente presente tutto il substrato la velocità segue un andamento rettilineo (v0), a mano a mano che il substrato viene consumato la velocità rallenta fino a raggiungere un plateau quando tutto il substrato è stato convertito in prodotto.

9 Concentrazione del substrato Concentrazione dell’enzima Temperatura pH
La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dai seguenti fattori Concentrazione del substrato Concentrazione dell’enzima Temperatura pH Inibitori

10 CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO
A parità di altre condizioni (temperatura, concentrazione di enzima, pH, ecc.) riportando in grafico la concentrazione di substrato in funzione della v0 si ottiene una curva iperbolica. Si osserva che, nel primo tratto della curva (rettilineo) la v0 è direttamente proporzionale alla concentrazione di substrato (aumentando la concentrazione di S aumenta proporzionalmente il numero di molecole che formano il complesso ES). Una volta raggiunta una certa concentrazione di S la v0 cresce più lentamente fino a raggiungere un valore massimo quando tutto l’enzima è saturato dal substrato e pur continuando ad aumentare la concentrazione di S la v0 rimane costante (Vmax). E’ possibile risalire alla velocità di una reazione enzimatica dall’equazione v0= Vmax [S] / [S] + Km proposta dai due studiosi Michaelis e Menten. Nell’equazione, v è la velocità di reazione, Vmax la velocità massima, [S] la concentrazione del substrato e Km è la costante di Michaelis-Menten. Km corrisponde alla concentrazione di S alla quale la velocità è = Vmax/2

11 Equazione di Michaelis-Menten
Vmax [S] v0 = Km + [S] A basse concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più piccola di Km e quindi trascurabile, si ha v0 = Vmax [S] / Km cioè, la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. Ad alte concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più grande di Km, Km diventa trascurabile e si ha v0 = Vmax, cioè, la velocità è la massima, indipendentemente dalla concentrazione del substrato. I valori di Km variano moltissimo da enzima ad enzima ed esprimono l’affinità che l’enzima ha per il substrato. Osservando la posizione di Km sul grafico velocità contro concentrazione di substrato, si può notare che se Km è bassa, in ogni istante è necessaria una bassa concentrazione di substrato per saturare metà delle molecole di enzima e questo è segno di alta affinità dell’enzima per il substrato, mentre se Km è alta, occorre una più alta concentrazione di substrato per saturare metà delle molecole di enzima in ogni istante e questo vuol dire che l’enzima presenta bassa affinità per il substrato. Il valore di Km è indipendente dalla concentrazione dell'enzima e dalla concentrazione del substrato.

12 1 KM 1 Vmax [S] = + v0 ………… Vmax
Per un calcolo più accurato della Vmax e della Km è opportuno trasformare matematicamente l’equazione di Michealis-Menten facendo il reciproco di entrambi i lati dell’equazione 1 KM Vmax [S] v0 = Vmax + Vmax [S] v0 = Km + [S] ………… Si ottiene il grafico dei doppi reciproci (o grafico di Lineweaver-Burk) mediante il quale la curva iperbolica viene convertita in una retta

13 Km è indipendente dalla concentrazione dell’enzima
v0 5 La velocità iniziale v0 di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima. Km è indipendente dalla concentrazione dell’enzima Unità enzimatica: quantità di enzima capace di trasformare una mmole di S in 1 minuto a 25 °C nelle condizioni ottimali del saggio. È quindi possibile misurare l’attività di un enzima (cioè la sua concentrazione espressa come unità per volume o per g di peso fresco o secco) mediante una misura della Vo ed in particolare della Vmax. Tali misure si effettuano utilizzando una concentrazione saturante di substrato ( 5 volte la Km quando la vo=Vmax) e monitorando la reazione nei primi minuti, quando tutto il substrato è praticamente disponibile.

14 TEMPERATURA La velocità delle reazioni enzimatiche varia col crescere della temperatura secondo il grafico a campana riportato. Si può osservare che, inizialmente, la velocità cresce al crescere della temperatura, raggiunge un massimo in corrispondenza di una certa temperatura definita ottimale, si riduce, in seguito, per effetto della denaturazione dell’enzima. pH Come la variazione della temperatura, in modo un poco più complesso, anche la variazione del pH influenza la velocità delle reazioni enzimatiche. Anche in questo caso, la curva presenta un andamento a campana e l’attività enzimatica manifesta un massimo in corrispondenza di un valore definito pH ottimale legato alla natura del substrato.

15 Inibitori I + E EI inattivo IRREVERSIBILE Ki
In molti casi, molecole specifiche o ioni possono competere con le molecole di substrato nel legarsi con l’enzima ed inibire l’attività dell’enzima. L’inibizione può essere irreversibile e reversibile. IRREVERSIBILE E’ irreversibile quando l’inibitore si va a legare al sito catalitico dell’enzima con un legame molto forte, impedendo l’accesso del substrato. I + E EI inattivo Ki Un esempio di inibizione irreversibile è dato dall’azione dei gas nervini che bloccano l’azione dell’enzima acetilcolinesterasi, un enzima che ha un ruolo importantissimo nella trasmissione degli impulsi nervosi.

16 REVERSIBILE COMPETITIVA NON COMPETITIVA
L’inibizione reversibile può essere competitiva, quando gli inibitori sono, da un punto di vista chimico, molto simili alle molecole di substrato e si legano agli stessi siti attivi, e non competitiva, quando gli inibitori si legano a siti dell’enzima diversi da quelli che legano il substrato e, pertanto, possono legarsi sia all’enzima che al complesso ES. COMPETITIVA L’inibitore possiede una struttura molto simile a quella del substrato la similitudine porta il substrato e l’inibitore a competere per lo stesso sito attivo dell’enzima. L’esito della competizione dipende dalla concentrazione delle due molecole che si contendono il sito attivo Può essere completamente rimossa aumentando notevolmente la concentrazione di substrato L’inibitore si lega all’enzima in una zona diversa da quella del sito attivo dando luogo al complesso EI inattivo. Il legame dell’inibitore deforma la conformazione spaziale dell’enzima ed il suo sito catalitico pur potendosi legare al substrato risulta inattivo. NON COMPETITIVA

17 E’ possibile distinguere la inibizione competitiva da quella non competitiva
1/Vmax In presenza di inibitore per ottenere la stessa velocità di reazione che in sua assenza, è necessario aumentare la concentrazione di substrato. La Vmax rimane invariata (infatti a concentrazione elevata di substrato tutta l’inibizione viene rimossa) mentre la Km aumenta - 1/Km diminuisce. A qualsiasi concentrazione di substrato la velocità di reazione in presenza di inibitore è sempre minore che in sua assenza. Quindi la Vmax diminuisce 1/Vmax aumenta, mentre la Km rimane costante.