Laboratorio n° 4: Inoculo di Patogeni fogliari. Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Importanza delle malattie fungine fogliari 1.2. Seconda fase.

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1 Laboratorio n° 4: Inoculo di Patogeni fogliari

2 Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Importanza delle malattie fungine fogliari 1.2. Seconda fase del postulato di Kock 1.3. Tecniche di inoculo di patogeni fogliari 1.4. Quantificazione dell’inoculo attraverso l’utilizzo della camera conta globuli (emacitometro) Attività di laboratorio 3.1. Selezione e preparazione dei campioni vegetali 3.2. Preparazione delle sospensioni di spore fungine 3.3. Inoculo dei patogeni 3.4. Rilievo dei sintomi sul materiale inoculato

3 I postulati di Koch I postulati di Koch sono originalmente dei criteri destinati a stabilire la relazione di causa-effetto che lega un microrganismo ad una malattia. Koch isolò dai tessuti di animali malati i bacilli del carbonchio, li coltivò in laboratorio e ne identificò il ciclo vitale di tipo sporigeno. Attraverso l'inoculazione delle cellule in animali non affetti da alcuna patologia osservò l'insorgenza della malattia e la possibilità di isolare tale microrganismo dal tessuto degli animali infettati sperimentalmente. Questi criteri sono conosciuti appunto come postulati di Koch.microrganismo Robert KochRobert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente alcuni criteri che altro non sono se non quattro regole generali per stabilire se un certo microrganismo sia o meno la causa di una certa malattia.malattia I postulati sono i seguenti: 1_ deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura puracoltura pura 2_ ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattiacoltura purasuscettibile 3_il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

4 I postulati di Koch 1° 2° 3°

5 L’inoculo dei funghi fitopatogeni Numerosi funghi fitopatogeni producono spore (conidi derivanti da riproduzione asessuata) atte alla diffusione del fungo. Botrytis spp. Fusarium spp.

6 Penicillium spp.

7 Le spore possono essere utilizzate a fini sperimentali per riprodurre l’inoculo di un determinato fungo in condizioni controllate e con un potenziale di inoculo noto. L’inoculo dei funghi fitopatogeni fogliari Oltre alle spore possono essere utilizzati per l’inoculo anche: - Micelio fungino - Tasselli di substrato agarizzato colonizzato dai funghi In tal caso però non è possibile quantificare con certezza il livello di inoculo che si utilizza.

8 Le spore possono essere applicate all’apparato fogliare sulla superficie intatta (senza ferita) o su ferite appositamente prodotte (con ferita) in quantità definita. L’inoculo dei funghi fitopatogeni fogliari Successivamente, il materiale inoculato può essere incubato in camera umida o con livelli di umidità ambientali.

9 Quantificazione dell’inoculo L’inoculo con spore deve essere quantificato contando il numero di spore presenti nella soluzione da utilizzare Tale operazione si effettua attraverso il vetrino conta globuli o emacitometro PROCEDURA: 1_In appositi quadrati si contano il numero di spore presenti (da effettuare in almeno 8-10 quadrati) 2_Il numero di spore nella soluzione (n° / ml) si ottiene moltiplicando la media dei quadrati X 250,000 3_Una volta calcolata la concentrazione di spore nella nostra soluzione si calcolano ed effettuano le diluizioni necessarie per ottenere la concentrazione di spore desiderata 4_Infine, la soluzione ottenuta viene applicata sulle foglie

10 Esempio di inoculo di funghi fitopatogeni fogliari

11 Stato delle foglie di pomodoro dopo 60 ore dall’inoculo Controllo: 0% sansa Suolo ammendato con 1% sansa Suolo ammendato con 3% sansa Fig. 13 Sviluppo dell’infezione di Botrytis (tacche necrotiche) dopo 60 ore dall’inoculo sulle piante di controllo e sulle piante crescite su substrato arricchito con l’1% e il 3% di sansa. Il livello di infezione è risultato superiore nelle piante cresciute su sansa.

12 Stato delle foglie di pomodoro dopo 90 ore dall’inoculo Controllo: 0% sansa Suolo ammendato con 1% sansa Suolo ammendato con 3% sansa Fig. 14 Sviluppo dell’infezione di Botrytis (tacche necrotiche) dopo 90 ore dall’inoculo sulle piante di controllo e sulle piante crescite su substrato arricchito con l’1% e il 3% di sansa. Il livello di infezione è risultato superiore nelle piante cresciute su sansa.

13 Attività di laboratorio

14 Selezione e preparazione dei campioni vegetali Lavaggio in acqua corrente per eliminare i residui grossolani Lavaggio con ipoclorito di sodio al 3% per eliminare altri microrganismi (sterilizzazione superficiale) Lavaggio con acqua sterile per eliminare l’ipoclorito Asciugare i campioni

15 Preparazione delle sospensioni fungine Porre 10 ml di acqua sterile nelle piastre. Successivamente, frizionare la superficie con un’ansa (permette il distacco delle spore) Prelievo delle soluzioni e filtrazione con lana di vetro (trattiene il micelio ma permette il passaggio delle spore) Conta delle spore e preparazione delle soluzioni da inoculare alla concentrazione desiderata: 1_Bassa concentrazione: 100,000 spore / ml ; 1 x 10 5 spore / ml 2_Alta concentrazione: 1,000,000 spore / ml; 1 x 10 6 spore / ml Porre 100 µl di inoculo sulle foglie (2 gocce per ogni foglia), successivamente lasciar asciugare. Inoculo da effettuare su foglie intatte e ferite (taglio di 5 mm effettuato con bisturi)

16 Computo materiali - campioni vegetali (frutti di agrumi e foglie di fagiolo) - sistemi pianta-patogeno: 1 – Agrumi + Penicillium; 2 – Fagiolo + Botrytis - bisturi (n° 6) - Piastre petri dei due miceti - Acqua sterile e soluzione 0.1% Tween 40 - Filtri lana di vetro sterili - Vetrino tipo Burke (emacitometro) - Tubi Falcon (15 ml) sterili Inoculo patogeni fogliari