A.A. 2015-2016 CORSO INTEGRATO DI INFORMATICA E BIOINFORMATICA per il CLT in BIOLOGIA MOLECOLARE Scuola di Scienze, Università di Padova Docenti: Prof.

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1 A.A. 2015-2016 CORSO INTEGRATO DI INFORMATICA E BIOINFORMATICA per il CLT in BIOLOGIA MOLECOLARE Scuola di Scienze, Università di Padova Docenti: Prof. Alessandro Sperduti (Informatica) Prof. Stefania Bortoluzzi (Bioinformatica)

2 WORKING WITH BIOSEQUENCES Alignments and similarity search

3 Traduzione di sequenze di DNA Ricerca di similarità BLAST WORKING WITH BIOSEQUENCES Alignments and similarity search

4 TRADUZIONE DI SEQUENZE DI DNA >ALBUMIN_mRNA AGTATATTAGTGCTAATTTCCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTTGGC ACAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTC GTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT GGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAA GTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCC TTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGC AAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTG GTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACT TATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAA AGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTT CGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAA GAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTC CAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGAT GACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCT GTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTT GCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTC TTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGAC TTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAA AGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTT GAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGT CAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAG AAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTT CAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA TATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCT GCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGC CTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGAT CAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATT TCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGT ACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTG TTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACT CTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

5 6 FRAMES DI TRADUZIONE per la stessa sequenza TRADUZIONE DI SEQUENZE DI DNA +1 ACTGGCTGAGATC +2 ACTGGCTGAGATC +3 ACTGGCTGAGATC -1 GATCTCAGCCAGT -2 GATCTCAGCCAGT -3 GATCTCAGCCAGT Codice genetico

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8 RICERCA DI SIMILARITÀ SIMILARITA’  ?  OMOLOGIA OMOLOGIA proprieta’ di caratteri (sequenze) dovuta alla loro derivazione dallo stesso antenato comune SIMILARITA’ “grado” di somiglianza tra 2 sequenze La similarita’ osservata tra due sequenze PUO’ indicare che esse siano omologhe, cioe’ evolutivamente correlate La similarita’ e’ una proprieta’ quantitativa, si puo’ misurare L’omologia e’ una proprieta’ qualitativa, non si puo’ misurare. La similarita’ tra sequenze si osserva, l’omologia tra sequenze si puo’ ipotizzare in base alla similarita’ osservata. Percentuale di similarita’ Ricerca di similarita’

9 OMOLOGIA E OMOPLASIA Omologia similarita’ dovuta a derivazione dallo stesso antenato comune Omoplasia similarita’ dovuta a convergenza, stessa pressione selettiva su due linee evolutive puo’ condurre a caratteri simili ORTOLOGIA E PARALOGIA OMOLOGIA ANTENATO COMUNE ORTOLOGIAPARALOGIA PROCESSO DI SPECIAZIONEDUPLICAZIONE GENICA Descrivo le relazioni tra geni di una famiglia intraorganismo (paralogia) o tra diversi organismi (ortologia )

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11  Dimensioni delle banche dati  Ripetitività delle ricerche  Lentezza degli algoritmi “esatti” Sistemi rapidi ma approssimati di allineamento Metodi euristici per l’allineamento gli algoritmi esatti effettuano delle ricerche esaustive ed esplorano tutto lo spazio degli allineamenti possibili (programmazione dinamica) si tratta comunque di algoritmi di ordine n 2, ovvero per allineare due sequenze lunghe ognuna 1000 residui, effettuano 1000x1000 = un milione di confronti: troppo lenti!!!! la crescita esponenziale delle dimensioni delle banche dati di sequenze biologiche ha portato allo sviluppo di programmi (come FASTA e BLAST) in grado di effettuare velocemente ricerche di similarità, grazie a soluzioni euristiche che sono basate su assunzioni non certe, ma estremamente probabili. In pratica la ricerca è resa più veloce a scapito della certezza di avere veramente trovato la soluzione migliore.

12 BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Altschul 1990) L’ algoritmo di BLAST e’ euristico e opera: 1Tagliando le sequenze da comparare in piccoli pezzi (parole) 2Ignorando tutte le coppie di parole (sequenza query/database) la cui comparazione da’ un punteggio inferiore ad un limite fissato 3Cercando di estendere tutte le hits rimanenti sino a che l’allineamento locale raggiunge un certo punteggio Dati una SEQUENZA QUERY ed un DATABASE DI SEQUENZE, BLAST ricerca nel database “parole” di lunghezza almeno “W” con un punteggio di similarita’ di almeno “T” una volta allineate con la sequenza “query” (HSP, High Scoring Pairs). Le “parole” selezionate vengono estese, se possibile, fino a raggiungere un punteggio superiore a “S” oppure un “E-value” inferiore al limite specificato.

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14 1- Seeding In sequenze di DNA W = 7 In sequenze proteiche W = 2- 3

15 2 - Extension La fase successiva comporta l’estensione dei seed L’estensione avviene in entrambe le direzioni Blast ha un meccanismo per decidere quando fermare l’estensione

16 The quick brown fox jumps over the lazy dog ||| ||| ||||| | | || The quiet brown cat purrs when she sees him The quick brown fox jump ||| ||| ||||| | The quiet brown cat purr 123 45654 56789 876 5654 000 00012 10000 123 4345 3 - Evaluation Estensione verso destra >>>> Diamo punteggio +1 a ciascun match –1 a ciascun mismatch. Calcoliamo il drop off score a partire dal massimo raggiunto (punteggio 9). Quando il drop off raggiunge 5, si interrompe l’estensione. Score -> drop off score ->

17 Two-hits algorithm Le word-hits tendono a clusterizzare lungo le diagonali L’algoritmo two-hits richiede che le word-hits siano entro una distanza prestabilita

18 ATAGGGCACTTT-GCGATGA ** * *** ** ***** ATTGCCCACGTTCGCGATCG Sequenze allineate Osservazione Ipotesi alternative OMOLOGIA? CASO? Significatività di un allineamento

19 Il risultato di una ricerca di similarita’ e’ una lista dei migliori allineamenti, tra la sequenza query e le sequenze “estratte” dal database. La SIGNIFICATIVITA’ di ciascun allineamento si calcola come P value o E value P value e’ la probabilita’ di ottenere un allineamento con punteggio uguale o migliore di quello osservato Si calcola mettendo in relazione il punteggio osservato (S) con la distribuzione attesa di HSP quando si comparano sequenze random della stessa lunghezza e composizione di quella in analisi (query sequence) Piu’ il P value e’ vicino a 0 piu’ e’ significativo 2x10 -245 e’ meglio do 0.001 !!! E value e’ il numero atteso di allineamenti con punteggio uguale o migliore di quello osservato Piu’ e’ basso piu’ e’ buono

20 Significatività di un allineamento Allineamento (matrice Blosum62, gap=-11) Seq1 V D C - C Y Seq2 V E C L C Y Score 4 2 9-11 9 7 Score = 20 Sequenze randomizzate Seq1 Seq2 C D V Y C C V Y L E C Sequenze originali Seq1 Seq2 V D C C Y V E C L C Y Allineamento (matrice Blosum62, gap=-11) Seq1 Seq2 C D V Y - C C V E Y L C Score = 9 Score 9 -3 -2 7 -11 9 Score allineamento (20) Distribuzione score casuali Frequenza Score Ripetere (es. 10.000 volte) salvando tutti i punteggi

21 Usare BLAST OPZIONI Sequenza querynucleotidica proteica (sequenza in formato FASTA, GenBank Accession numbers o GI numbers) Databasedatabase di seq. nucleotidiche database di seq. proteiche ProgrammaStandard BLAST (blastn) Standard protein BLAST (blastp) translated blast (blastx, tblastn, tblastx) MEGABLAST PSI-BLAST PHI-BLAST … Blast selection table http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/producttable.shtml

22 Usare BLAST database di seq. nucleotidiche nr All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS, or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences). No longer "non- redundant". est Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from EST division. est_human est_mouse htgs Unfinished High Throughput Genomic Sequences yeast Saccharomyces cerevisiae genomic nucleotide sequences mito Database of mitochondrial sequences vector Vector subset of GenBank(R), NCBI, in month All new or revised GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences alu Select Alu repeats from REPBASE, suitable for masking Alu repeats from query sequences. dbsts Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from STS division. chromosome Searches Complete Genomes, Complete Chromosome, or contigs form the NCBI Reference Sequence project.

23 Usare BLAST PROGRAMMI Blastn Nucleotide query - Nucleotide db Blastp Protein query - Protein db Translating BLAST attraverso la traduzione concettuale della query sequence o dei database permette di comparare una sequenza nucleotidica con database di proteine o viceversa. Translated query - Protein db blastx Protein query - Translated db tblastn Translated query - Translated db tblastx MEGABLAST usa un algoritmo greedy (ingordo) veloce ed ottimizzato per comparare sequenze che differiscono poco Search for short nearly exact matches blastn con parametri scelti in modo da ottimizzare la ricerca di matches quasi esatti e brevi. Questi si trovano spesso per caso, percio’ utilizza alto E-value, piccola dimensione della parola e filtering PSI-BLAST Find members of a protein family or build a custom position- specific score matrix PHI-BLAST Find proteins similar to the query around a given pattern

24 WWW BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

25 WWW Blast: Risultati …

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29 Allineamento multiplo di sequenze >Hs_jun-B MCTKMEQPFYHDDSYTATGYGRAPGGLSLHDYKLLKPSLAVNLADPYRSLKAPGARGPGPEGGGGGSYFS GQGSDTGASLKLASSELERLIVPNSNGVITTTPTPPGQYFYPRGGGSGGGAGGAGGGVTEEQEGFADGFV KALDDLHKMNHVTPPNVSLGATGGPPAGPGGVYAGPEPPPVYTNLSSYSPASASSGGAGAAVGTGSSYPT TTISYLPHAPPFAGGHPAQLGLGRGASTFKEEPQTVPEARSRDATPPVSPINMEDQERIKVERKRLRNRL AATKCRKRKLERIARLEDKVKTLKAENAGLSSTAGLLREQVAQLKQKVMTHVSNGCQLLLGVKGHAF >Pt MCTKMEQPFYHDDSYTTTGYGRAPGGLSLHDYKLLKPSLAVNLADPYRSLKAPGARGPGPEGGGGGSYFS GQGSDTGASLKLASSELERLIVPNSNGVITTTPTPPGQYFYPRGGGSGGGAGGAGGGVTEEQEGFADGFV KALDDLHKMNHVTPPNVSLGATGGPPAGPGGVYAGPEPPPVYTNLSSYSPASASSGGAGAAVGTGSSYPT TTISYLPHAPPFAGGHPAQLGLGRGASTFKEEPQTVPEARSRDATPPVSPINMEDQERIKVERKRLRNRL AATKCRKRKLERIARLEDKVKTLKAENAGLSSTAGLLREQVAQLKQKVMTHVSNGCQLLLGVKGHAF >Bt MCTKMEQPFYHDDSYAAAGYGRTPGGLSLHDYKLLKPSLALNLSDPYRNLKAPGARGPGPEGNGGGSYFS SQGSDTGASLKLASSELERLIVPNSNGVITTTPTPPGQYFYPRGGGSGGGAGGAGGGVTEEQEGFADGFV KALDDLHKMNHVTPPNVSLGASGGPPAGPGGVYAGPEPPPVYTNLSSYSPASAPSGGAGAAVGTGSSYPT ATISYLPHAPPFAGGHPAQLGLGRGASAFKEEPQTVPEARSRDATPPVSPINMEDQERIKVERKRLRNRL AATKCRKRKLERIARLEDKVKTLKAENAGLSSTAGLLREQVAQLKQKVMTHVSNGCQLLLGVKGHAF >Clf MCTKMEQPFYHDDSYAAAGYGRAPGGLSLHDYKLLKPSLALNLADPYRSLKAPGARGPGPEGSGGSSYFS GQGSDTGASLKLASSELERLIVPNSNGVITTTPTPPGQYFYPRGGGSGGGAGGAGGGVTEEQEGFADGFV KALDDLHKMNHVTPPNVSLGASSGPPAGPGGVYAGPEPPPVYTNLNSYSPASAPSGGAGAAVGTGSSYPT ATISYLPHAPPFAGGHPAQLGLGRGASTFKEEPQTVPEARSRDATPPVSPINMEDQERIKVERKRLRNRL AATKCRKRKLERIARLEDKVKTLKAENAGLSSTAGLLREQVAQLKQKVMTHVSNGCQLLLGVKGHAF

30 1.Progressive multiple alignment STEPS IN MULTIPLE ALIGNMENT xxxxxxxxxxxxxxx

31 Clustal Omega Allineamento multiplo di sequenze

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33 Predizione della struttura delle proteine Ricostruzione Albero filogenetico Motivi di sequenza conservati …

34 Jalview

35 Structure comparison, modelling Interaction networks Hierarchical function annotation: homologs, domains, motifs Phylogenetic studies Human genetics, SNPs Therapeutics, drug discovery Therapeutics, drug design DBD LBD insertion domain binding sites / mutations Gene identification, validation RNA sequence, structure, function Comparative genomics Multiple alignment MSA: a central role in biology (and medicine)