Spettrometria di massa e spettrometri di massa - 1

Presentazione sul tema: "Spettrometria di massa e spettrometri di massa - 1"— Transcript della presentazione:

1 Spettrometria di massa e spettrometri di massa - 1

2 History of MS Instrumentation

3 MS: un secolo di storia…
1912 Prima MS MS di ioni secondari 1952 Strumenti a doppia focalizzazione 1965 Risonanza ionica di ciclotrone 1984 Interfaccia a fasci di particelle 1968 Ionizzazione elettrospray 1918 Ionizzazione elettronica e focalizzazione magnetica 1946 MS a tempo di volo                                 1966 Ionizzazione chimica Analizzatori a quadrupolo 1974 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica …e cinque Premi Nobel 1906 1922 1989 2002 J.J. Thomson F.W. Aston W. Paul J.B. Fenn K. Tanaka

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5 Mass Spec Principles General operation of MS Sample Ion Source
(MALDI, ES) Sample + _ Mass Analyzer (Q, TOF, IonTrap) Detector General operation of MS create gas-phase ions separate ions in time or space by their mz ratio measure the quantity of ions

6 Mass vs. mass-to-charge ratio **measure m/z not mass (Da) or charge
Definitions: Mass vs. mass-to-charge ratio **measure m/z not mass (Da) or charge Mass spectrum Height / area = quantitative (# ions) Abundance m/z

7 Differenti spettri di massa
Mass (Da) 0.4 Da

8 (a + b)n Isotope Peaks for High Molecular Weight Species
C C C C12C12C C C12C12C (3 forms) C13C12C C C v. small 13C13C13C C 13C or 13C12C C 13C BINOMIAL EXPANSION (Yergey, Anal. Chem. 1983, 55, 353) (a + b)n # of atoms Abundance heavy isotope Abundance light isotope

9 C60 C100 Rel. Abund. Rel. Abund. 12C60 100 12C100 100
12C5913C C9913C1 110 12C5813C C9813C2 60 12C5713C C9713C3 22 C60 C100 *isotope peaks from other element not included H, O, N, S, ...!! large MW ® many isotope peaks What is molecular weight?

10 C60 C100

11 Mass Spectrometry Characteristic isotope abundances
N and O have a negligible effect S and Si have a small effect Cl gives a distinct isotope pattern (35Cl/37Cl ratio is 100/32) Distinct isotope patterns are also seen for other heteroatoms

12 Mass resolution: represents the ability to separate two adjacent masses and measures the "sharpness" of the MS peak. Mass resolution is calculated as the ratio of the mass of the peak divided by its width.

13 Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati risolti se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale dell’altezza del picco meno intenso (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

14 Effects of resolution on A50+ Elemental composition:
C H N O

15 Mass accuracy indicates the accuracy of the mass information provided by the mass spectrometer Mass accuracy is the difference observed between the theoretical mass and the measured mass: Dm accuracy = mreal – mmeasured expressed in parts per million (ppm): ppm = 106 * ∆m accuracy / mmeasured i.e.: theoretical mass: 1000, measured mass: error: 100 ppm

16 Mass accuracy: elemental composition of organic ion mixture analysis (telling what’s what) Peak at m/z = 102, 12C51H1016O2+ or 12C6 1H14 16O+ ? z = m = Accuracy = Dm /m = 1/R = 3.6 x 10-4 x 106 = 360 ppm many other possible formulas, usually need ± 10 ppm or better

17 Ion Source Ion Focusing Vacuum Mass Analyser Data Acquisition Detector
DI, GL, LC, CE Ion Source Sample Introduction Ion Focusing EI, MALDI, ESI Mass Spectrum m/z Vacuum Mass Analyser B, E, Q, TOF, R MS/MS Data Acquisition Detector Mass Analyser(s)

18 Sample Introduction Direct inlet (gas, liquid, solid, solution)
Gas Chromatography (GC/MS) High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC/MS) Multidimensional Chromatography (Capillary separation systems)

19 Sorgenti ioniche Per GC: Ionizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI) Per LC: Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) MALDI (off line)

20 MALDI

21 La ionizzazione Maldi prevede l’ irradiazione con una luce laser (l 337 nm) di una piccola superfice (100 mm di diametro) in cui è posto il campione, cristallizzato con una matrice, con conseguente riscaldamento dell’area di irradiazione e e vaporizzazione delle molecole organiche .

22 Mechanisms of matrix assisted laser desorption/ionization
The matrix serves three major functions: Isolation of the biomolecules from each other The biomolecules are incorporated in a large excess of matrix molecules, strong intermolecular forces are thereby reduced (matrix isolation). One of the most important conditions for matrices to work well is an intimate mixing of the analyte and the matrix. optimal molar ratios are in the 1:1000 to 1:10000 (analyte to matrix) range. This means that analyte molecules are singularly and fully surrounded (solvated) by matrix molecules.

23 La matrice assorbe energia dall’irradiazione della luce laser, si riscalda e può agire conseguentemente come donatore di protoni formando ioni pseudomolecolari di tipo [M+H]+. Per composti con una elevata affinità per i cationi si possono formare anche addotti di tipo [M+Na]+, [M+K]+.

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25 BACKGROUND SPECTRA FROM MATRIX

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27 m/z range needs to be high for MALDI (e.g. TOF)

28 Size Determination of Human immunoglobulin IgM by MALDI, MW = ~1 MegaDalton
R.W. Nelson et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 625 (1995).

29 Recent Maldi-MS Advances
Greatly increased sensitivity (10 fmol) Much higher resolution due to advances in vacuum and ability to control “width” of injected sample (“delayed extraction”) Maldi is VERY high throughput, so processing of multiple samples is feasible

30 Vantaggi e svantaggi Senza limite di massa registrabile
Buona sensibilità Problemi nella deposizione della matrice e del campione Bassa risoluzione Ioni dello stesso tipo che partono dalla matrice in tempi diversi Generazione di ioni metastabili Ioni dello stesso tipo che acquistano differenti Ec nella fase di accellerazione

31 Risoluzione

32 Spettro MALDI-TOF di un anticorpo monoclonale
Determinazione della massa molecolare con MALDI-TOF Spettro MALDI-TOF del peptide Angiotensina II Spettro MALDI-TOF di un anticorpo monoclonale

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34 ESI La sostanza è introdotta in soluzione in un ago capillare e ne fuoriesce sotto forma di aerosol (goccioline di diametro di 1-2mm). Tra l’ago e il mantello della camera (elettrodo cilindrico) è creata una differenza di potenziale di alcuni KV che induce sulle goccioline un eccesso di carica positiva. A causa delle loro ridotte dimensioni, il solvente evapora rapidamente da ogni gocciolina che diventa sempre più piccola; la densità di carica aumenta finchè diventa così alta da determinare l’espulsione di ioni di soluto dalla gocciolina. Gli ioni così prodotti sono poi spinti attraverso un sistema di fenditure fino ad entrare nella zona a bassa pressione dove sono accelerate verso l’analizzatore

35 Electrospray Ionization (ESI)
ul/min 2-5 kV applied to tip Spectra characterized by multiply-charged ions!! (keeps m/z much lower than MALDI) Solutions: water / MeOH / HOAc (49/49/2%) [+ve mode] polar organics – decrease surface tension too much aqueous – can’t form stable spray

36 Nano-electrospray (nESI)- very low flow (~ 10 nl/min)
1-2 kV Tip ~ 1 um ID Draw silica capillary (similar to micropipets) Advantages No external pumping needed Disposable Smaller droplets (move needle closer to aperture) More efficient than ESI Lower sample consumption (10 ul lasts hours!) Spray at physiological conditions!! (good for non-covalent interaction analysis) Wilm and Mann, Anal. Chem., 68, 1-8 (1996).

37 M + nH+  [M + nH]n+ (polypeptides)
low pH favors protonated cations [M - nH]n- (nucleic acids) high pH favors less common (corona discharge problem) [M+cat]+ [M+anion]- can help or hurt with adduct formation too much salt interferes

38 Una delle caratteristiche dell’ESI è la possibilità di generare ioni multicarica. Per molti composti il numero di cariche è proporzionale alla grandezza del composto in esame per cui il rapporto m/z per le molecole che arrivano all’analizzatore è dell’ordine di Inoltre il numero di cariche assunte dalla molecola dipende sia dalla presenza di gruppi basici che dal pH del solvente.

39 Qual è la massa

40 Quadrupole Mass Analyzers
+U +Vcos(t) U Vcos(t) Per un dato valore dei potenziali solo gli ioni con un singolo valore del rapporto m/z raggiungono il rivelatore. La scansione di uno spettro si ottiene facendo variare simultaneamente Vcc e Vac, mantenendo costante il loro rapporto. Sono piu’ piccoli, piu’ leggeri e meno costosi dei sistemi a settore. Di solito pero’ hanno una risoluzione minore ( 2000) e possono rilevare m/z solo fino a  4000.

41 Come si calcola il p.m da una serie di ioni multicarica?
Picchi consecutivi differiscono per una carica. m/z= (M+n)=1546 m/z= (M+n+1)=1374 n n+1 M e n

42 m/z MIXTURE TWO PROTEINS M1 = 10,000 M2 = 22,000 *USE INTENSITY
ENVELOPE TO ID RELATED IONS!! M1 + 5H+ M2 + 10H+ m/z

43 LC-MS L’ESI è la sorgente di ionizzazione di prima scelta negli apparecchi LC-MS. Il problema da considerare derivano dalla necessità di interfacciare la camera di ionizzazione, che è sotto vuoto spinto, e l’apparecchio HPLC a pressione ordinaria