Dimostrazioni che il DNA è il materiale genetico.

Presentazione sul tema: "Dimostrazioni che il DNA è il materiale genetico."— Transcript della presentazione:

1 Dimostrazioni che il DNA è il materiale genetico

2 Griffith nel 1928 utilizzò due forme di Streptococcus pneumonie, un ceppo innocuo, non capsulato ceppo R, che forma colonie di aspetto ruvido e un ceppo patogeno, capsulato, (responsabile della polmonite) che forma colonie di aspetto liscio ceppo S. Iniettati nei topolini, i batteri del ceppo ruvido non ne provocavano la morte, mentre i batteri del ceppo liscio la provocavano, a meno che non fossero stati uccisi in precedenza mediante riscaldamento. Quando i topolini venivano iniettati con una miscela di batteri patogeni uccisi e di batteri innocui vivi, i topolini morivano e si riusciva ad estrarre batteri vivi patogeni dai topolini morti. Griffith chiamò trasformazione questo processo di cambiamento di batteri innocui in patogeni (Fig. 3)..

3 Avery, MacLeod, and McCarty, 1944 Altri scienziati successivamente dimostrarono che il principio trasformante era il DNA e che perciò il DNA trasportava l’informazione genetica. Infatti distruggendo selettivamente i costituenti cellulari degli estratti di pneumococchi patogeni usando degli enzimi che idrolizzano il DNA, l’RNA o le proteine, la trasformazione non avveniva solo se era stato distrutto il DNA.

4 Il fago T4 il fago T2 induceva nella cellula batterica un ciclo litico, con lisi finale della cellula e liberazione di particelle virali. Per duplicarsi, i geni del fago dovevano penetrare nel batterio; occorreva scoprire quale dei propri componenti cellulari i fagi iniettavano nel batterio

5 Hersey e Chase (1952) dettero un ulteriore contributo alla dimostrazione che le informazioni genetiche erano contenute nel DNA e non nelle proteine.. A tal fine, questi scienziati resero radioattivi, in due esperiemnti diversi, rispettivamente le proteine e il DNA del virus, sfruttando il fatto che solo le proteine contengono Zolfo (S) mentre solo il DNA contiene il fosforo (P).

6 Prepararono pertanto due campioni distinti di T2: in uno le proteine erano marcate con l’isotopo radioattivo zolfo 35 (S35), nell’altro il Dna era marcato con l’isotopo radioattivo fosforo 32 (P32). Il batterio era poi infettato con i fagi e dopo un tempo sufficiente, batteri e fagi venivano separati per agitazione e centrifugazione. Quando il batterio veniva infettato col fago T2 contenente proteine marcate, la maggior parte della radioattività rimaneva all’esterno della cellula ospite; quando il batterio era infettato col fago T2 contenente DNA marcato, il DNA radioattivo era iniettato all’interno della cellula e si aveva produzione di fagi. Il DNA quindi portava l’informazione genetica del virus

7 Un anno importante, il 1953, ricordato anche e soprattutto per un articolo su Nature firmato da James D. Watson e Francis H. Crick, in cui i due studiosi propongono per la prima volta il modello a doppia elica della struttura del Dna. Con questa intuizione nasce la biologia molecolare, una branca feconda, che permette di approfondire le conoscenze sui meccanismi dell'ereditarietà biologica e dell'espressione dei geni, un campo che apre la strada a nuove prospettive, teoriche e pratiche, non ultima l'ingegneria genetica. Di Watson e Crick è anche una prima ipotesi sul possibile meccanismo di duplicazione della molecola di Dna: le due eliche si separano e ciascuno dei due filamenti dirige la sintesi della parte complementare. Una replicazione semiconservativa, in cui le nuove molecole sono composte da un filamento nuovo e uno vecchio

8 DUPLICAZIONE DEL DNA La scoperta del preciso appaiamento di basi tra le due catene sugger isce immediatamente un meccanismo con cui il DNA si può replicare, producendo due doppie eliche da una parentale. Poiche' l'adenina e' sempre accoppiata alla timina e la guanina e' sempre accoppiata alla citosina, le sequenze delle due catene sono sempre complementari tra loro. La complementarieta' delle due catene, suggerisce come la molecola potrebbe pilotare la propria duplicazione secondo un meccanismo noto come replicazione semiconservativa del DNA. Il primo passo verso la replicazione semiconservativa e' la separazione delle due catene complementari l'una dall'altra nel punto in cui deve iniziare la replicazione.

9 Meselson and Stahl nel 1957 dimostrano che ciascun filamento di una doppia elica di DNA funge da stampo per un nuovo filamento, un processo chiamato replicazione semi conservativa del DNA. L’esperimento E. coli cresciuto in azoto 15N (heavy isotope). Trasferiti ad azoto 14N (light) e lasciati crescere per una due o tre generazioni Prendere campioni di DNA take samples of DNA. Mescolare con cloruro di cesio e separare DNA leggero e pesante

10 Experimental Methods

11 DNA leggero, pesante ed intermedio separati per centrifugazione

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15 Direction of replication

16 Le cellule contengono una proteina che si attacca specificamente al duplex del DNA, in modo che le catene complementari si separano per un breve tratto l'una dall'altra. Una volta verificatasi un'interruzione circoscritta del duplex, ognuna delle due catene e' libera di funzionare come stampo per la polimerizzazione di una nuova catena complementare. L'enzima DNA polimerasi seleziona i nucleotidi che si possono appaiare con le basi della catena stampo e lega i deossinucleotidi uno dopo l'altro con legami fosfodiesterici. Il risultato complessivo del processo replicativo e' che si creano due duplex figli di DNA, che sono ciascuno identico a quello parentale quanto a sequenza di coppie di basi. Il processo di replicazione del DNA avviene nella fase S del ciclo cellulare, in modo che il patrimonio genetico sia duplicato per la successiva divisione cellulare, e che le due cellule figlie possiedano quindi ciascuna un patrimonio genetico unicoproteinaciclo cellulare

17 1.E.coli DNA polymerase I - "Klenow". 2.2. E.coli DNA polymerase III – l’enzima principale è stato scoperto per terzo 3. E.coli DNA topoisomerase I - relassa ilDNA e facilita l’apertura dell’elica 4. E.coli DNA Ligase – lega tra loro i frammenti di Okazaki 5. E.coli RNA primase è necessaria per iniziare la sintesi, poiché la DNA polimerasi ha bisogno di un innesco. L’RNA sarà poi degradato e sostituito da DNA 6. E.coli DNA Single-Stranded Binding proteins (SSB) mantiene i due filamenti separati

18 Dimensioni reali. Guarda l'immagine da sola.Guarda l'immagine da sola.

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25 How many enzymes have we named that allow DNA replication to occur at the rate necessary for life? Scientists have discovered dozens of enzymes that are used by human cells in this process. Your cells and their ability to carry on our heredity are fantastically complex! The separate short strands of DNA made on the lagging strand of the replicating molecule are called Okazaki fragments. They were named after the Japanese scientist who discovered them. These short strands are annealed or "glued" together to form the second complete DNA molecule.

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27 The average human chromosome contains 150 x 10 6 nucleotide pairs which are copied at about 50 base pairs per second. The process would take a month (rather than the hour it actually does) but for the fact that there are many places on the eukaryotic chromosome where replication can begin. Replication begins at some replication origins earlier in S phase than at others, but the process is completed for all by the end of S phase. As replication nears completion, "bubbles" of newly replicated DNA meet and fuse, finally forming two new molecules.

28 Origins of replication sites (ORI's) are areas on the DNA molecule that are recognized by proteins which attach to the DNA and initiate the replication process. Our full complement of DNA has numerous sites where replication begins, and the replication proceeds in both directions from the start of this site. This area is described as a replication fork; it is often described as "Y" shaped. Since the molecule is antiparallel, the DNA forms along one parental strand in a continuous manner while the DNA forms along the other parental strand (away from the fork) in a discontinuous manner. An enzyme, DNA polymerase allows the DNA nucleotides to bond to the parental strand. Polymerases can only add DNA nucleotides to strands which are already paired in a complementary fashion. Thus, RNA primases build primer RNA in short segments of the lagging strand to ease the polymerase requirement. Study the diagram and notice that the RNA nucleotide is cut out and ejected by the polymerase while the DNA nucleotide is added.