CALORIMETRIA La CALORIMETRIA è la misura quantitativa del calore richiesto o rilasciato durante un processo chimico. La misura si effettua con un calorimetro.

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1 CALORIMETRIA La CALORIMETRIA è la misura quantitativa del calore richiesto o rilasciato durante un processo chimico. La misura si effettua con un calorimetro. Verrà descritta la tecnica di: - calorimetria di titolazione isoterma

2 La calorimetria di titolazione isoterma (ITC) è una tecnica termodinamica per studiare reazioni indotte da un reagente aggiunto al sistema. E’ molto usata per reazioni biochimiche. Quando il reagente è aggiunto, viene generato o acquisito del calore e la misura di questo calore permette la determinazione accurata della costante di legame (K B ), della stechiometria della reazione (n), dell’entalpia (  H) e dell’entropia (  S), dando quindi un profilo termodinamico completo del sistema con un singolo esperimento.

3 In un tipico esperimento ITC di un sistema biochimico, una soluzione di “macromolecola” viene titolata con un “ligando” introdotto con una siringa a temperatura costante. Quando il ligando è iniettato nella cella avviene l’interazione ed il calore svolto o acquistato è proporzionale alla quantità di legame formato. Quando la macromolecola nella cella è saturata dal ligando il segnale termico diminuisce fino al valore del calore di diluizione.

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5 Nell’esperimento in figura, 18 aliquote di ligando sono state aggiunte alla proteina. L’area relativa al segnale di ogni aggiunta (in alto) è proporzionale al calore totale rilasciato per ogni aggiunta. Quando il calore integrato viene riportato in funzione del rapporto molare tra ligando e macromolecola, viene ottenuta l’isoterma di legame (in basso). La curva interpolata (in rosso) permette di ottenere i migliori parametri termodinamici (stechiometria, costante di legame e entalpia del processo).

6 La determinazione precisa della concentrazione di macromolecola e di substrato è importante. La quantità di calore svolto per aggiunta del ligando è: V o = volume della soluzione in cella  H b = entalpia per mole di ligando [M] t = concentrazione totale di macromolecola K a = costante di legame [L] = concentrazione di ligando libero

7 L’equazione è ricavata in questo modo:

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9 Importante: Le equazioni sono ricavate in accordo con un modello di interazione. Nel caso precedente: un unico sito di interazione per macromolecola. Se più ligandi si legano alla macromolecola bisogna modificare l’equazione del Q inserendo la stechiometria con un modello di siti uguali ed indipendenti. Se i siti sono n per ogni macromolecola:

10 Per classi multiple di siti uguali ed indipendenti si ha: Va fatta però attenzione al fatto che nel modello di siti uguali ed indipendenti la costante di equilibrio NON è uguale per tutti i singoli processi di legame, è la costante microscopica che è uguale. Di conseguenza anche l’entalpia di processo è quella microscopica del singolo ligando che lega la macromolecola.

11 Poiché il calorimetro misura qualsiasi quantità di calore prodotto o acquistato va considerato anche il calore di protonazione o deprotonazione (entalpia di ionizzazione) legato al tampone utilizzato nell’esperimento. In questo caso può essere utile fare due esperimenti con diversi tamponi a diversa entalpia di ionizzazione.

12 I reagenti vanno dializzati con cura contro il tampone per evitare differenze di concentrazione del tampone nelle soluzioni da mescolare che producono calore di diluizione non eliminabile. Le soluzioni vanno de-gassate per evitare la formazione di bolle che peggiora la linea di base.

13 Per ottenere n, K a e  H b, l’equazione generale: viene espressa in termini di concentrazione totale di ligando:

14 Per passare dalla prima alla seconda espressione: Da questa seconda espressione si ottiene una quadratica che risolta dà i valori di [M b ] (uno solo dei due ha senso fisico) che introdotti nella prima espressione danno il valore di [L f ] che può essere introdotto nell’espressione generale.

15 Espressione quadratica per [M b ]: Solo una delle due soluzioni avrà un valore positivo per [M b ] I parametri sono ottenuti con un metodo di best-fit come il Marquardt

16 La concentrazione di macromolecola e di ligando è critica per una buona misura: - la concentrazione iniziale di macromolecola e ligando va misurata accuratamente - è comodo valutare il parametro c = K a [M] n Per una determinazione accurata della costante di equilibrio è consigliato lavorare con c = 1 ÷ 1000. Valori grandi di c portano a pochi punti sperimentali nella zona di equivalenza Valori piccoli di c portano ad una zona di sigmoidale molto allargata (quasi lineare) dove è difficile valutare il punto di equivalenza.

17 Un esempio di studio con calorimetria di titolazione isoterma: interazione del Citocromo c di cuore di cavallo con anticorpi monoclonali. L’anticorpo lega in prossimità della lisina 60

18 E’ stato dimostrato che, sebbene la superficie di contatto tra anticorpo ed antigene sia grande (650 – 1000 Å 2 ), solo pochi residui di amminoacidi contribuiscono all’interazione. Questo può essere confermato con la calorimetria. Esperimento di calorimetria per l’interazione del Cyt c con l’anticorpo MAb 5F8. Il titolante è l’anticorpo. Non poteva essere calcolata la costante di legame (troppo alta) e quindi non ci sono punti nella zona di equivalenza. K a è stata valutata mediante un esperimento di titolazione per fluorescenza

19 La variazione di energia libera è stata calcolata da:  G 0 = -RT lnK a Conoscendo il  H calorimetrico è stata valutata  S: K a = 1,4 x 10 10 (M -1 )  G 0 = - 13,9 (kcal/mole)  H = - 21,7 (kcal/mole)  S = -26,3 (cal/mole K)  C p = - 172 (cal/mole K) =-719 (joule/mole K) Diminuzione di entropia → minor mobilità dei gruppi coinvolti nell’interazione (catena laterali, acqua). Il valore della variazione della capacità termica è misurato con esperimenti a diversa temperatura

20 Eseguendo titolazioni in tamponi diversi può essere calcolato il numero di protoni scambiati durante il processo di legame. L’entalpia di ionizzazione nel tampone fosfato è molto minore di quella in TRIS-HCl (1 kcal/mole; 11 kcal/mole). tris(idrossimetil)amminometano cloridrato Se la variazione di entalpia misurata in TRIS è meno esotermica di quella in fosfato allora i protoni sono acquisiti dal sistema durante la complessazione.

21 Il  H apparente (  H associazione +  H protonazione) è: Non può essere stabilito se i protoni sono presi dall’anticorpo o dal citocromo, ma il loro numero totale è noto dall’equazione: Si ottiene scrivendo la formula di  H b app per i due tamponi e sostituendo in  H b Nel caso in esame il trasferimento di protoni è praticamente zero.