Durante la via glicolitica che avviene nel citosol il glucosio viene convertito in piruvato. In condizioni aerobiche tramite la decarbossilazione ossidativa.

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1 Durante la via glicolitica che avviene nel citosol il glucosio viene convertito in piruvato. In condizioni aerobiche tramite la decarbossilazione ossidativa del piruvato si forma acetil coenzima A (acetil CoA) Il ciclo di Krebs è la via finale comune per l’ossidazione delle molecole di sostanze nutrienti riconducibili a tre gruppi essenziali rappresentati da aminoacidi, acidi grassi e carboidrati. Negli eucarioti le reazioni del ciclo di Krebs hanno luogo nei mitocondri

2 Acidi grassi Glucosio Ac. Piruvico Glucosio Pi Trigliceridi AA Ribulosio-5-P Glucosio-6-P Ac. Ossalacetico Ac.  -Chetoglutarico Ac. Fumarico Succinil-CoA Acetoacetil-CoA Acil-CoA Acidi grassi Ac. Lattico  -ossidazione Biosintesi degli acidi grassi Shunt dei pentoso fosfato Glicolisi Gluconeogenesi Glucidi Lipidi Protidi Glicogenosintesi Glicogenolisi ATP Acetil-CoA Glucosio-1-P AA Glicogeno Ciclo di Krebs Corpi chetonici

3  The matrix contains Pyruvate Dehydrogenase, enzymes of Krebs Cycle, and other pathways, e.g., fatty acid oxidation & amino acid metabolism. Localization of Krebs Cycle: Glycolysis occurs in the cytosol of cells. Pyruvate enters the mitochondrion to be metabolized further. Mitochondrial Compartments:

4  Inner membrane infoldings, called cristae, contain constituents of the respiratory chain & ATP Synthase. The inner membrane is the major permeability barrier. The inner membrane is the major permeability barrier. It contains various transport catalysts, including a carrier protein that allows pyruvate to enter the matrix. It contains various transport catalysts, including a carrier protein that allows pyruvate to enter the matrix. Mitochondrial compartments

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6 Il ciclo di Krebs non utilizza direttamente l’ossigeno per alcuna delle sue reazioni, tuttavia necessita del metabolismo ossidativo dei mitocondri per la riossidazione dei nucleotidi ridotti. Il ciclo di Krebs ha due importanti funzioni: produrre energia e fornire precursori per le biosintesi

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11 L’azione tossica del cianuro si esplica attraverso l’inibizione dello stato terminale nel sistema di ossidazione: il piruvato non si ossida ulteriormente nel ciclo dell’acido citrico, ma piuttosto si riduce a lattato I cianuri sono usati in metallurgia e l’esposizione ad acido cianidrico può avvenire nei laboratori chimici o nella combustione di materie plastiche (nitrocellulosa e poliuretani)

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14 Il substrato di partenza per il ciclo di Krebs è l’acetil- Coenzima A (acetil-CoA), un prodotto comune dell’ossidazione dei carboidrati, degli acidi grassi e degli aminoacidi. L’acetil-CoA viene ossidato per permettere la riduzione dei coenzimi coinvolti nelle quattro reazioni di ossidazione del ciclo In particolare, queste reazioni generano tre molecole di nicotinamide adenina dinucleotide ridotto (NADH) ed una molecola di flavin adenina dinucleotide ridotto (FADH 2 ) che, mediante la catena di trasporto degli elettroni accoppiata alla fosforilazione ossidativa, rilasceranno l’energia libera necessaria alla sintesi di ATP

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17 La formazione di acetil CoA avviene nella matrice mitocondriale e rappresenta il legame tra la glicolisi ed il ciclo di Krebs, la reazione irreversibile è catalizzata dal complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi

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19 L’enzima piruvato deidrogenasi è un complesso formato da tre tipi di enzimi: piruvato deidrogenasi (E1), diidrolipoil transacetilasi (E2), diidrolipoil deidrogenasi (E3) I cofattori catalitici necessari per questi enzimi sono rispettivamente: la tiamina pirofosfato (TPP) coinvolta nella decarbossilazione ossidativa del piruvato, la lipoamide coinvolta nel trasferimento del gruppo acetile al CoA, ed il FAD coinvolto nella rigenerazione della forma ossidata della lipoamide

20 Pyruvate Dehydrogenase is a large complex, with multiple copies of each of 3 enzymes: E 1, E 2 & E 3.

21 Pyruvate Dehydrogenase Subunits

22 Dopo la formazione della acetildiidrolipoamide ad opera dell’enzima E1, il braccio flessibile di E2 sposta il gruppo acetildiidrolipoamidico al sito di legame del CoA, dove si forma acetil- CoA. La diidrolipoamide ridotta si sposta su E3 dove viene riossidata a lipoamide. Il FADH 2 è successivamente riossidato a FAD dal NAD +, producendo NADH e rigenerando l’enzima attivo

23 Lipoamid e includes a dithiol that undergoes oxidation/ reduction.

24 Gli arsenicati trivalenti (es arsenito inorganico) sono considerati composti in grado di reagire con i gruppi sulfidrici. In tal modo inibiscono numerosi enzimi in quanto reagiscono con ligandi biologici contenenti gruppi –SH disponibili, come ad esempio la lipoamide

25 Organic arsenicals are potent inhibitors of lipoamide-containing enzymes such as Pyruvate Dehydrogenase. These highly toxic compounds react with “vicinal” dithiols such as the functional group of lipoamide.

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27 Il ciclo dell’acido citrico inizia con la condensazione di una unità a quattro atomi di carbonio, l’ossalacetato, con una unità a due atomi di carbonio, il gruppo acetile dell’acetil CoA L’ossalacetato reagisce con acetil CoA e con acqua generando citrato e CoA. La reazione è catalizzata dalla citrato sintasi

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29 Il citrato viene isomerizzato a isocitrato per permettere all’unità a sei atomi di carbonio di subire una decarbossilazione ossidativa. L’isomerizzazione del citrato avviene tramite una tappa di deidratazione seguita da una di idratazione che porta ad uno scambio di posizione tra un atomo di idrogeno ed un gruppo ossidrilico. L’enzima che catalizza entrambe le tappe è chiamato aconitasi, in quanto il cis-aconitato è un intermedio della reazione

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31 L’aconitasi contiene atomi di ferro che sono complessati con quattro solfuri inorganici e quattro atomi di zolfo di altrettanti residui di cisteina. Questo complesso ferro-zolfo si lega al citrato e partecipa alla deidratazione e reidratazione del substrato (citrato) legato all’enzima (aconitasi)

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33 Il fluoroacetato, isolato originariamente dalle piante, è un potente veleno. Esso viene attivato come fluoroacetil-CoA e si condensa con l’ossalacetato per formare fluorocitrato. Il 2-fluorocitrato è un potente inibitore dell’aconitasi e causa l’inibizione del ciclo di Krebs che può portare alla morte. Il fluoroacetato è un esempio di “substrato suicida”, cioè un composto che non è di per sé tossico, ma che viene metabolicamente trasformato in un derivato tossico

34 A questo punto del ciclo iniziano le quattro reazioni di ossido-riduzione, la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato è catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi. L’intermedio di questa reazione è l’ossalsuccinato, quando questo composto è legato all’enzima perde CO 2 e forma  -chetoglutarato

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36 La seconda reazione di decarbossilazione ossidativa è catalizzata dal complesso dell’  - chetoglutarato deidrogenasi che porta alla formazione del succinil CoA

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38 Il legame tioestere tra il succinato ed il CoA è un legame ad alta energia e la scissione del legame tioestere del succinil CoA è accoppiata alla fosforilazione della guanosina difosfato con formazione di GTP Il GTP viene utilizzato come donatore di gruppi fosforici nella sintesi proteica e nei processi di trasduzione di segnali extracellulari

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43 La fase finale del ciclo prevede la rigenerazione dell’ossalacetato Il succinato viene convertito in ossalacetato in tre tappe: una ossidazione, una idratazione ed una seconda reazione di ossidazione Il succinato è ossidato a fumarato dalla succinato deidrogenasi, questo enzima come l’aconitasi è una proteina ferro-zolfo

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45 La succinato deidrogenasi è parte integrale della membrana interna dei mitocondri ed è direttamente legata alla catena di trasporto degli elettroni Il FADH 2 prodotto dall’ossidazione del succinato non si dissocia dall’enzima come accade invece al NADH prodotto nelle altre reazioni di ossidazione L’idratazione del fumarato, catalizzata dalla fumarasi, porta alla formazione del malato che viene successivamente ossidato ad ossalacetato tramite la malato deidrogenasi

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48 Il ciclo dell’acido citrico è la via principale di degradazione per la generazione di ATP e nello stesso tempo è in grado di produrre intermedi per i processi di biosintesi. Per esempio, la maggioranza degli atomi di carbonio della porfirina deriva dal succinil-CoA e molti degli aminoacidi derivano dall’  - chetoglutarato e dall’ossalacetato

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50 La velocità del ciclo è finemente regolata dalla necessità di ATP della cellula. La disponibilità di NAD + e di FAD segnala che la carica energetica è bassa. La sintesi del citrato dall’ossalacetato e dall’acetil CoA è un importante punto di controllo del ciclo L’ATP è un inibitore allosterico della citrato sintasi. L’effetto dell’ATP è quello di aumentare la K M dell’enzima per l’acetil CoA. Quando i livelli di ATP aumentano, la frazione di enzima saturato con acetil CoA diminuisce e si forma meno citrato