Annu. Rev. Biomed. Eng. 2004. 6:77–107 TISSUE GROWTH AND REMODELING Stephen C. Cowin The New York Center for Biomedical Engineering and the Departments.

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1 Annu. Rev. Biomed. Eng. 2004. 6:77–107 TISSUE GROWTH AND REMODELING Stephen C. Cowin The New York Center for Biomedical Engineering and the Departments of Biomedical and Mechanical Engineering, School of Engineering, City College and Graduate School, The City University of New York, New York 10031; email: scowin@earthlink.net scowin@earthlink.net Un tessuto è un materiale composito i cui costituenti, che ne determinano la struttura, si modificano in continuazione a causa dell’accrescimento e in risposta all’ambiente fisico e chimico in cui si trova il tessuto. L’ambiente fisico-chimico di un tessuto è rappresentato dall’ambiente in cui si trova e dalla sua storia recente. Un tessuto è un insieme di cellule e della matrice extracellulare (ECM) che realizzano funzioni specifiche. L’ECM è fatto di fibre (es. le proteine del collagene e l’elastina) e una sostanza di base (es. proteoglicani). Rispetto ad altri tessuti, il connettivo ha relativamente poche cellule e molto materiale extracellulare; comprende: cartilagine, tendini, ligamenti, la matrice dell’osso, il tessuto adiposo (grasso), la cute, il sangue e la linfa. I tessuti maturi possono rimodellare il loro ECM per adattarne la struttura ai carichi meccanici che deve sostenere e che ha sostenuto.

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3 Il fibroblasto è un tipo di cellula che sintetizza la matrice extracellulare e il collagene, l’impalcatura strutturale dei tessuti animali e gioca un ruolo critico nella riparazione delle ferite. I fibroblasti sono le cellule più comuni dei tessuti connettivi degli animali

4 MYOFIBROBLASTS AND MECHANO-REGULATION OF CONNECTIVE TISSUE REMODELLING James J.Tomasek, Giulio Gabbiani, Boris Hinz, Christine Chaponnier and Robert A.Brown NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 3 | MAY 2002 | 349 Quasi tutti i tessuti connettivi sono apparentemente soggetti a qualche tipo di tensione meccanica, anche in condizioni di riposo. Ad eccezione di persone molto anziane o con certi difetti genetici, i connettivi molli non si raggrinzano, nemmeno intorno a muscoli rilasciati o nel sonno. La tensione di riposo che è intrinseca nell’anatomia dei tessuti è resa evidente dal fatto che i vasi e i nervi quando vengono sezionati assumono una lunghezza del 25-30% minore rispetto a quella che hanno in situ. Lo stabilirsi di questa situazione durante la crescita infantile si spiega se la crescita dei tessuti molli è governata da una “tensione esterna di soglia”. Ne nascono parecchi quesiti: qual è la base cellulare e molecolare di questa omeostasi tensionale dei tessuti? Come si mantiene nell’adulto? E infine come si ripristina nell’adulto durante la riparazione dei tessuti? Un altro esempio di sviluppo di tensione nel tessuto connettivo è rappresentato dalla contrazione delle ferite che si verifica durante la guarigione di una ferita aperta. Molti tessuti sono in tensione meccanica, ma questo non significa che anche le cellule siano in tensione, perché sono protette da carichi esterni relativamente grandi grazie alle proprietà meccaniche della matrice che le circonda. In termini ingegneristici queste cellule sono “schermate dalla tensione” ad opera della matrice che esse stesse producono e rimodellano.

5 Riparazione di ferite normale e patologica La riparazione di ferite cutanee comprende due fenomeni: la riepitelizzazione, cioè la riproduzione e lo spostamento di cellule epidermiche per ricostruire la continuità del tessuto e la formazione ex novo e la contrazione del tessuto di granulazione, fatto di piccoli vasi, fibroblasti, miofibroblasti e diverse quantità di cellule infiammatorie. Quando la riepitelizzazione è completa, si verifica un’importante riduzione di elementi cellulari, soprattutto miofibroblasti, nel tessuto di granulazione, a causa di fenomeni apoptotici, e si forma una cicatrice con poche cellule. In molti casi, per cause non identificate, la cicatrizzazione non ha luogo, nonostante la riepitelizzazione e il tessuto di granulazione si trasforma in una cicatrice ipertrofica (cheloide), che contiene molti miofibroblasti e non produce abbastanza matrice extracellulare. Questo processo si chiama FIBROSI e deforma il parenchima circostante e il tessuto connettivo. La formazione della fibrosi è stata attribuita all’insufficienza di fenomeni apoptotici nella fase finale della guarigione della ferita. Questo schema generale della formazione di fibrosi vale per molti organi dopo diversi tipi di lesione (per es. rene, polmone, fegato e cuore). È ora accertato che il miofibroblasto (un fibroblasto specializzato nella contrazione) gioca un ruolo importante nello stabilire la tensione durante la riparazione di ferite e nella contrattura patologica.

6 Il MIOFIBROBALSTO. Da molto tempo si è ritenuto che la contrazione del tessuto dipendesse da forze generate dalla retrazione del collagene. Molte osservazioni hanno però indicato che le cellule del tessuto di granulazione sono coinvolte nella generazione di forza. È stato dimostrato che molti fibroblasti contengono un’actina SM (smooth muscle), quella dei muscoli lisci vascolari, e che l’espressione di tale molecola e del collagene di tipo I è regolata dal fattore di trasformazione (transforming growth factor, TGF-ß1). Tutto questo dimostra che il miofibroblasto ha un ruolo nella sintesi dell’ECM e nella generazione di forza che riorganizza l’ECM e provoca la retrazione delle ferite. I miofibroblasti sono caratterizzati dalla presenza di un apparato contrattile che contiene fasci di microfilamenti di actina con altre proteine contrattili (miosina non muscolare). Queste fibre terminano sulla superficie cellulare nel fibrobnesso, un complesso di adesione specializzato che lega gli elementi intracellulari a quelli extracellulari. Questo costituisce un sistema di trasduzione meccanica che trasmette le forze generate nella cellula all’ECM e viceversa. I miofibroblasti, come i muscoli lisci vasali, sono direttamente collegati fra di loro attraverso gap junctions e pertanto possono formare unità contrattili multicellulari durante la retrazione del tessuto di granulazione

7 Miofibroblasti nella membrana epiretinica. Ricostruzione tridimensionale mediante microscopia confocale laser di un miofibroblasto differenziato. Colorazione immunoistochimica dell’actina; i colori cambiano in funzione della profondità. I miofibroblasti differenziati mostrano le tipiche “fibre da stress” Ci sono due tipi di miofibroblasti, quelli che non esprimono a-SM actina, che proponiamo di chiamare protomiofibroblasti e quelli che la esprimono, che chiamiamo miofibroblasti differenziati. La differenza è particolarmente evidente in vivo, mentre in vitro sono quasi tutti del primo tipo. I segnali responsabili della formazione di protomiofibroblasti si conoscono poco, ma la tensione meccanica è certamente importante. Un altro fattore importante è il PDGF (platelet derived GF)

8 Il modello a due stadi della differenziazione del miofibroblasto. In vivo, i fibroblasti possono contenere actina sulla membrana ma non presentano fibre da stress e non formano complessi di adesione con l’ECM. Sotto stress meccanico si differenziano in protomioblasti che formano fibre da stress contenenti actina che terminano nel fibronesso. Possono generare forza contrattile. Il TGF -ß1 aumenta l’espressione di fibronectina e in presenza di stress meccanico provoca la trasformazione in miofibroblasti differenziati che aumentano l’espressione di actina e di grossi complessi di adesione. Questo aumenta lo sviluppo di forza e organizza la fibronectina extracellulare in fibrille

9 Non è chiaro se i miofibroblasti e le cellule muscolari lisce (SM) siano tipi cellulari distinti oppure se i primi non siano che un momento di uno spettro di differenziazione continua fra fibroblasto e SM. Tale spettro potrebbe spiegare il processo di vasculogenesi nel quale le cellule SM della media si differenziano da fibroblasti locali, come accade nell’ipertensione polmonare. REGOLAZIONE DELLA CONTRAZIONE DEI MIOFIBROBLASTI I miofibroblasti possono mantenere forza contrattile a lungo. La forza è generata da “stress fibres” contrattili – formate da fasci di microfilamenti di actina associati a miosina non muscolare – ed è regolata dalla fosforilazione della catena leggera della miosina (MLC), analogamente a quando accade nelle cellule SM. Entrano in gioco due sistemi di fosforilazione: MLCK (chinasi calcio dipendente) e il sistema della Rho chinasi. L’aumento del calcio intracellulare attiva la MLCK, provocando una contrazione rapida e breve perché la concentrazione del calcio diminuisce rapidamente e una fosfatasi disattiva la MLCK. Al contrario, l’attivazione della Rho chinasi ha due possibilità di fosforilare la MLC: in modo diretto oppure inattivando la fosfatasi della miosina. Questo provoca contrazioni sostenute

10 Contrattura in lattice di collagene tridimensionale. Il diagramma schematico forza-tempo rappresenta tre fasi di generazione di forza. Le varie fasi si sovrappongono. L’aggiunta di citocalasina D subito dopo il raggiungimento del plateau abolisce completamente la forza, mentre l’aggiunta più tardiva lascia una forza residua, dovuta al rimodellamento (accorciamento) irreversibile della rete collagene, che è tipico della contrattura

11 Modello della fase di rimodellamento della matrice extracellulare nella contrattura. La contrattura della matrice è mediata dai miofibroblasti: la contrazione dei miofibroblasti si trasforma in accorciamento funzionale della matrice collagene. A) i miofibroblasti sono annegati in una rete collagene e si legano alle fibrille mediante complessi di fibronectina legati ai filamenti intracellulari. B) Le fibre da stress si contraggono; l’effetto è locale e si trasmette a poche cellule circostanti. C) si aggiungono nuovi componenti della matrice che stabilizzano la nuova organizzazione del collagene. D) il ciclo si ripete fino a provocare la contrattura

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13 Modello del ruolo dei miofibroblasti nella riparazione di una ferita aperta. A) nei tessuti normali i fibroblasti sono sottoposti ad una moderata tensione grazie alla protezione dallo stress esercitata dalla matrice circostante per cui non è stimolata l’organizzazione di un citoscheletro contrattile (area rosa del derma). Quando una ferita del derma a tutto spessore è riempita da un coagulo di fibrina, fattori di crescita locali stimolano i fibroblasti del tessuto adiacente sano ad invadere la matrice provvisoria. Questi fibroblasti emigrati, insieme ai vasi, riempiono la ferita formando tessuto di granulazione. A questo punto, i fibroblasti sono già stimolati a produrre fibronectina. B) I fibroblasti esercitano forze di trazione sulla matrice collagene, che viene riorganizzata secondo linee di forza. Lo sviluppo di stress meccanico stimola i fibroblasti a sviluppare fibre di stress e così acquisiscono le caratteristiche di proto-miofibroblasti. La tensione e i fattori di crescita stimolano i proto-miofibroblasti a secernere il TGF-  1 e aumenta la fibronectina. In uno schema a feedback i proto- miofibroblasti diventano miofibroblasti differenziati sintetizzando actina aumentando la forza contrattile. Queste cellule differenziate depositano collagene e altri componenti dell’ECM e producono proteasi. Questo complicato processo di rimodellamento porta ad un accorciamento della matrice collagene e alla chiusura della ferita.

14 D) Quando una ferita che guarisce normalmente si chiude i miofibroblasti vanno incontro ad apoptosi e spariscono. E) In molte situazioni patologiche invece, come nella formazione di cicatrici ipertrofiche, i miofibroblasti persistono e continuano a rimodellare l’ECM con progressiva contrattura del connettivo. In conclusione, i miofibroblasti non sono affatto cellule “cattive”, ma la loro cattiva regolazione provoca disfunzioni tissutali.

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17 Remodelling of continuously distributed collagen fibres in soft connective tissues N.J.B. Driessen, G.W.M. Peters, J.M. Huyghe, C.V.C. Bouten, F.P.T. Baaijens Journal of Biomechanics 36 (2003) 1151–1158 Stimoli biochimici e biomeccanici provocano il rimodellamento della matrice extracellulare nei tessuti connettivi molli, che modificano la morfologia e il comportamento meccanico del tessuto stimolato: questo gioca un ruolo cruciale nell’ingegneria tissutale di strutture che sopportano carichi, come le cartilagini e le valvole cardiache. Il turnover delle fibre collagene è il risultato netto di sintesi e riassorbimento, con un riallineamento della direzione delle fibre, secondo la teoria della fusione dei polimeri. La resistenza alla deformazione è adattata tramite la riorganizzazione della matrice extracellulare, nella quale sono importanti sia il riallineamento di fibre collagene preesistenti sia il turnover delle fibre. Articolo di bioingegneria troppo difficile, ma utile per alcuni concetti di base

18 Acute exercise induced changes in rat skeletal muscle mRNAs and proteins regulating type IV collagen content S. O. A. KOSKINEN, W. WANG, A. M. AHTIKOSKI, M. KJÆR, X. Y. HAN, J. KOMULAINEN, V. KOVANEN, AND T. E. S. TAKALA Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 280: R1292–R1300, 2001. Il collagene di tipo IV è il componente principale delle membrane basali e probabilmente svolge un ruolo critico nella sistemazione delle cellule all’interno di un tessuto, per es. assicurando stabilità meccanica nelle fibre muscolari scheletriche, benché sia soltanto una minima frazione della matrice extracellulare. È stato dimostrato nei ratti che un allenamento di endurance protratto per tutta la vita aumenta il contenuto del collagene IV nel muscolo scheletrico e che il suo mRNA aumenta rapidamente dopo un episodio acuto di esercizio strenuo. Non è noto però quali siano i meccanismi e se un singolo episodio di esercizio strenuo modifichi la degradazione e la concentrazione del collagene IV. La degradazione proteolitica di specifici componenti dell’ECM che ha luogo sia in processi fisiologici sia patologici è attivata da proteasi zinco-dipendenti chiamate metallo proteinasi (MMP). Le MMP-2 e -9 distruggono il connettivo IV. L’attività delle MMP è regolata in modo complesso dalla separazione enzimatica di proMMP e dall’inibizione da parte di inibitori tissutali delle MMP, chiamati TIMPs. Esperimento: i ratti correvano su treadmill con inclinazione negativa a 17m/min per 130 min: questo modello di esercizio provoca danno muscolare.

19 Attività glucuronidasica misurata come indice di danno muscolare I risultati mostrano che la sintesi del collagene IV delle membrane basali si modifica sia a livello di mRNA si a livello delle proteine in seguito a danno muscolare indotto dall’esercizio. Il collagene fibrillare di I e III tipo è alterato solo a livello pretranslazionale. La MMP-2 che degrada il collagene IV aumenta soprattutto nella parte rossa del quadricipite, dove il danno cellulare è maggiore. Abbiamo anche dimostrato che l’espressione delle TIMP-1 e TIMP-2, le proteine che inibiscono la degradazione dell’ECM aumenta in momenti diversi del processo di degenerazione e rigenerazione del muscolo danneggiato.

20 TRANSLATIONAL PHYSIOLOGY The history of matrix metalloproteinases: milestones, myths, and misperceptions Rugmani Padmanabhan Iyer, Nicolle L. Patterson, Gregg B. Fields, and Merry L. Lindsey Am J Physiol Heart Circ Physiol 303: H919–H930, 2012. La famiglia delle MMP comprende ora 25 membri, non tutti presenti nell’uomo. Sono stati identificati 5 sottogruppi: collagenasi, gelatinasi, matrilisine, stromolisine e MMP di membrana. Per essere classificato come MMP un enzima deve avere i seguenti requisiti: 1) proteolisi di almeno un componente dell’ECM; 2) il sito attivo dipende dallo zinco; 3) attivazione da parte di proteinasi o organomercuriali; 4) inibizione da parte dell’acido etilen diamino tetra acetico, 1,10 fenantotriolina e una TIMP (inibitore tissutale delle MMP); 5) la sequenza del cDNA omologa alla MMP-1. Substrati. Non è vero che le MMP degradano solo le proteine dell’ECM: la loro azione sulle proteine superficiali delle membrane cellulari è un meccanismo importante per la regolazione delle attività delle cellule. La proteolisi può stimolare o inattivare particolari segnali intracellulari, come quelli che provocano apoptosi o autofagia. Attivazione: non è vero che le MMP si attivino solo nell’ambiente extracellulare. L’attivazione di proenzimi MMP avviene certamente fuori dalle cellule: plasmina, eparina e ossidanti attivano MMP e molte MMP ne attivano altre. Vi sono però eccezioni e molti enzimi possono essere attivati all’interno delle cellule. Le TIMPs: non servono solo per inibire le MMP, ma attivano anche fattori di accrescimento, stimolano i fibroblasti e la loro differenziazione in miofibroblasti.

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22 Eventuali usi terapeutici: l’idea che tutte le MMP abbiano funzioni negative è sbagliata e quindi non è detto che tutte le MMP debbano essere comunque bloccate se possibile. Sono state provate molte TIMP e piccole molecole sintetiche per bloccare le MMP nel cancro, nell’artrite e nelle malattie cardiovascolari, ma con scarso successo, per varie ragioni. È necessario chiarire il ruolo delle MMP nella progressione delle malattie cardiovascolari: quando e dove sono espresse MMP e TIMP, con che sequenza temporale. I diversi tipi di cellula vanno e vengono e le cellule si differenziano nel tempo e tutto questo cambia l’espressione di MMP e TIMP. Per esempio, i fibroblasti stimolati con il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) esprimono MMP -1, -2, -3, -11, -14 e TIMP-1 e-2 ma non MMP- 9. Ma se il fibroblasto si differenzia in miofibroblasto, allora produce MMP-9 in risposta al PDGF.