LO STRESS OSSIDATIVO.

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1 LO STRESS OSSIDATIVO

2 NO DANNI In condizioni fisiologiche esiste un equilibrio tra le specie ROS e le difese antiossidanti I fattori abiotici sono tra le principali cause di incremento delle specie ROS nel nostro organismo e, se tale incremento non viene neutralizzato dalle nostre difese antiossidanti, provoca lo STRESS OSSIDATIVO FUMO, RADIAZIONI IONIZZANTI, RAGGI UV INQUINAMENTO,METALLI PESANTI, ALCOL CATTIVA ALIMENTAZIONE, FARMACI INTENSA ATTIVITA’ FISICA INCREMENTO DEI ROS

3 Lo Stress ossidativo è uno stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente (ROS), secondario a: un’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti. ROS Difese antiossidanti

4 Tutte le SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO possiedono attività OSSIDANTE
+ Radicale (ossidante) A Nuova molecola (ridotta, stabile) Molecola bersaglio (doppio legame C-C) C Nuovo radicale (ossidante) Elettrone spaiato OSSIDAZIONE L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello STRESS OSSIDATIVO

5 La propagazione dei radicali liberi innesca una REAZIONE A CATENA che si espleta in tre fasi :
FASE INIZIALE : INNESCO FASE INTERMEDIA : PROPAGAZIONE (a sfavore delle macromolecole biologiche) FASE FINALE: TERMINAZIONE (sistemi di difesa antiossidante) ENZIMATICI: Catalasi Superossido dismutasi Glutatione perossidasi NON ENZIMATICI: VITAMINICI (vitamina C e E) NON VITAMINICI (polifenoli, glutatione)

6 Tutti gli antiossidanti possiedono attività RIDUCENTE
CATALASI E’ un enzima presente principalmente nei PEROSSISOMI ma anche nella frazione citosolica dove rimuove con efficienza H2O2 (1 molecola di catalasi può convertire ~ 6 milioni di molecole di H2O2 ad acqua ed ossigeno ogni minuto!). Rappresenta la difesa cellulare primaria contro il perossido di idrogeno H2O2

7 LA SUPEROSSIDO DISMUTASI
E’ uno dei più importanti enzimi antiossidanti nei mammiferi. Esistono molte forme comuni di SOD che possono avere cofattori metallici diversi. Nell’ uomo ne sono presenti tre differenti tipi: - Cu, Zn- SOD citosolica, Mn- SOD mitocondriale (biologicamente più importante) SOD extracellulare Sono tutte coinvolte nella dismutazione dell’anione superossido (O2- ), cioè nella rimozione catalitica del radicale superossido combinandolo a protoni per formare perossido di idrogeno e ossigeno: 2 O H+ H2O2 + O2 Rappresenta la difesa cellulare primaria contro l’anione superossido O2- .

8 LA GLUTATIONE PEROSSIDASI (GPX )
Metalloproteina contenente Selenio (cofattore), localizzata sia a livello della membrana cellulare che a livello extracellulare. Esistono due forme: Se - dipendente Se - indipendente. Catalizza, utilizzando il glutatione (GSH) come substrato e agente riducente, la riduzione di H2O2 ad acqua . Il perossido è un potenziale substrato della reazione di Fenton. Il GSH nella forma inizialmente ridotta (GSH) viene ossidato (GSSG). + 2H2O GSSGox H2O2 2GSHrid Rappresenta un importantissimo sistema di difesa contro i perossidi.

9 IL GLUTATIONE E’ un TRIPEPTIDE costituito da 3 amminoacidi : cisteina, glutammato e glicina. E’ il più importante antiossidante tiolico solubile intracellulare che l'organismo è in grado di produrre. La sua concentrazione è molto elevata nel citosol, nei nuclei e nei mitocondri. E’ il cofattore dell’enzima GLUTATIONE PEROSSIDASI e Il suo potere antiossidante deriva dalla capacità del gruppo tiolico – SH del residuo cisteinico di donare facilmente un e- passando dalla forma ridotta (GSH) alla forma ossidata (GSSG)

10 E’ rigenerato dall’ enzima GLUTATIONE REDUTTASI
E’ un enzima NADPH – dipendente Durante la riduzione del glutatione , il potere riducente è ossidato a NADP+ attraverso gli elettroni ceduti Il rapporto GSH/GSSG rappresenta una buona misura dello stress ossidativo di un organismo

11 La VITAMINA C o ACIDO ASCORBICO
E’ un antiossidante non enzimatico idrosolubile, spiccatamente acido. E’ presente sia in forma ossidata (deidroascorbato) che in forma ridotta (acido ascorbico). Interviene nella rigenerazione di α-tocoferolo mediante una reazione di ossidoriduzione (dona 1 elettrone al radicale tocoferrosile): Deidroascorbato + α-tocoferolorid Ascorbato + α-tocoferrosileox La rigenerazione di ascorbato ridotto avviene per opera di una ascorbato reduttasi NADPH-dipendente La sua attività antiossidante si esplica principalmente in associazione ad enzimi antiossidanti, carotenoidi (vitamina A) e vitamina E (ACE)

12 Deidroascorbato + α-tocoferolorid
Ascorbato + α-tocoferrosileox

13 La VITAMINA E o α - TOCOFEROLO
Esistono 8 tipi di vitamina E, fra queste l’ α -tocoferolo è la forma biologicamente più potente e attiva e rappresenta il più importante antiossidante liposolubile utilizzato dalle cellule. E’ presente sulle membrane cellulari e nelle lipoproteine plasmatiche. La sua attività antiossidante: è volta alla prevenzione dell’ossidazione degli acidi grassi polinsaturi , evento chiave nello sviluppo della perossidazione lipidica L’a-tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle membrane biologiche.

14 VITAMINA E L’α – tocoferolo è in grado di bloccare la perossidazione lipidica donando l’e- del suo gruppo idrossilico (OH) ai radicali perossilipidici, rendendoli meno reattivi e bloccando la loro perossidazione. Tale reazione trasforma l’α-tocoferolo in un radicale α-tocoferossilico, piuttosto stabile che può reagire con la vitamina C per riformare l’α-tocoferolo. VITAMINA E

15 Gli effetti dei RADICALI LIBERI sulle macromolecole biologiche
LIPIDI PROTEINE DNA Attacco agli acidi grassi polinsaturi di membrana con PEROSSIDAZIONE LIPIDICA Ossidano i residui aa delle proteine per formare DERIVATI IDROSSILATI. Alterazione strutturale e funzionale della proteina Ossidano le basi azotate generando BASI ANOMALE (idrossi - guanina o idrossi - adenina) Perdita di permeabilità Riduzione di flessibilità e selettività Irrigidimento Ossidazione Inattivazione Denaturazione Mutazioni Induzione alla cancerogenesi

16 METODI PER LA DETERMINAZIONE DI ANTIOSSIDANTI NON ENZIMATICI

17 ESTRAZIONE ANTIOSSIDANTI DA TESSUTO FRESCO
Pesare 0,3 gr di tessuto fresco (polpa, frutto, foglia) Rottura meccanica mediante pestelli e forbicine (in ghiaccio) SONICARE (induce lisi cellulare e rottura rapida e completa delle membrane ) OMOGENARE (POLYTRON) BUFFER ESTRAZIONE IDROSOLUBILE (metanolo, acqua e acido formico) Lasciare al buio per 2 ore in agitazione blanda

18 Centrifugare 3500 rpm, 15 min a 4° C
Sottoposto a 2^ estrazione Centrifugare 3500 rpm, 15 min a 4° C Surnatante (S1) pellet (P1) Surnatante (S2) pellet (P2) … Buffer estrazione: ACETONE Agitazione blanda per 2 ore al buio (S1) e (S2) sono stati riuniti: (S3) ESTRATTO IDROFILO

19 Centrifugare 3500 rpm, 5 min a 4° C Surnatante (S4) pellet (P3)
Sottoposto a 2^ estrazione Centrifugare 3500 rpm, 5 min a 4° C Surnatante (S4) pellet (P3) Surnatante (S5) pellet (P4) buttati (S4) e (S5) sono stati riuniti: (S6) ESTRATTO LIPOFILO

20 DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE (IDRO – LIPO) SOLUBILE TOTALE
Saggiare la CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE (IDRO – LIPO) SOLUBILE TOTALE significa rappresentare ciò che resta degli antiossidanti dopo aver neutralizzato i ROS Se c’è stress ossidativo = La capacità antiossidante totale è diversa dalla determinazione della concentrazione totale degli antiossidanti [ ROS] ma La capacità antiossidante

21 1^ METODO: DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE IDROSOLUBILE
Si allestisce un saggio in eppendorf (Vfinale = 1 ml) I campioni (C) : surnatanti idrosolubili (S3) precedentemente estratti Bianco C1 C2 C3 H2O (μl) 110,7 10,7 Sample (μl) / 100 Ammonio Molibdato(μl) 800 Acido solforico (μl) 33,3 Fosfato di sodio (μl) 56 Incubare a 95°C nel bagnetto termostatato per 1 ora e 30 minuti Raffreddare le mix di reazione Lettura spettrofotometrica ( λ = 695 nm)

22 y= 0,0118 x equazione della retta
Principio del metodo : Si basa sulla riduzione del molibdato con conseguente formazione del fosfomolibdato (il blu di molibdato) in ambiente acido . La riduzione avviene ad opera dell’ACIDO ASCORBICO Lo standard di riferimento per la costruzione della retta di calibrazione usato è: L’ACIDO ASCORBICO (1 nm/μl): y= 0,0118 x equazione della retta nM Abs (695 nm) 10 0,114 20 0,208 40 0,447 80 0,945 100 1,2

23 Y = 0,0118 x equazione della retta
capacità antiossidante idrosolubile espressa in nM totali/gr e rappresentata su di un ISTOGRAMMA Y = 0,0118 x equazione della retta nM / µlcaricati = nM/ µl (nM / µl ) X Vfinale = nM totali X = Abs 0,0118 = nM (nM totali / gr peso fresco ) 1) 2) 3) 4)

24 2^ METODO: DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE LIPOSOLUBILE
Si allestisce un saggio in eppendorf (Vfinale = 1 ml) I campioni (C) : surnatanti liposolubili (S6) precedentemente estratti Bianco C1 C2 C3 H2O (μl) 110,7 10,7 Sample (μl) / 100 Ammonio Molibdato(μl) 800 Acido solforico (μl) 33,3 Fosfato di sodio (μl) 56 Incubare a 37°C nel bagnetto termostatato per 1 ora e 30 minuti Raffreddare le mix di reazione Lettura spettrofotometrica ( λ = 695 nm)

25 Y = 0,020 x equazione della retta
Lo standard di riferimento per la costruzione della retta di calibrazione usato è: l’α – TOCOFEROLO (1 μM/μl): Vitamina E Y = 0,020 x equazione della retta µmol Abs 5 0,095 10 0,184 15 0,275 20 0,346 25 0,6

26 Y = 0,02 x equazione della retta
capacità antiossidante liposolubile espressa in μM totali/gr e rappresentata su di un ISTOGRAMMA Y = 0,02 x equazione della retta μM / µlcaricati = μM/ µl (μM / µl ) X Vfinale = μM totali X = Abs 0,02 = μM (μM totali / gr peso fresco ) 1) 2) 3) 4)

27 3^ METODO: DETERMINAZIONE DEI POLIFENOLI TOTALI
ANTIOSSIDANTI ESOGENI NON VITAMINICI (frutta, olive, cereali, cioccolato, legumi secchi, thè e caffè) Composti organici SOLUBILI in acqua Formati da più gruppi fenolici Comprendono: TANNINI, FLOVANOIDI e ACIDI FENOLICI

28 ALLESTIMENTO DEL SAGGIO (Vfinale = 1 ml)
Bianco C1 C2 C3 FOLIN (µl) 500 Sample (µl) / 100 H2O (µl) incubare i campioni a T ambiente per 4 minuti Carbonato di sodio (µl) 400 I campioni sono lasciati al buio per 2 ore Lettura allo spettrofotometro λ = 720 nm Principio del metodo: Il reattivo di folin ossida i composti fenolici in ambiente alcalino generando una miscela di colore blu Lo standard di riferimento per la costruzione della retta di calibrazione usato è: L’ACIDO GALLICO (0,1 mg/ml):

29 1) 2) 3) 4) X = Y = 0,138 X equazione della retta Abs = µg 0,138
µl caricati µg Abs 10 1 0,17 20 2 0,295 40 4 0,582 80 8 1,1 100 1,375 Y = 0,138 X equazione della retta µg / µlcaricati = µg/ µl (µg / µl ) X Vfinale = µg totali X = Abs 0,138 = µg (µg totali / gr peso fresco ) 1) 2) 3) 4) Determinazione dei polifenoli totali espressa in μg/grpeso fresco e rappresentata su di un ISTOGRAMMA

30 4^ METODO: metodo DPPH (DPPH • ) il 2, 2 – difenil – 1 – picrilideazil è un radicale stabile Il (DPPH •) in una soluzione contenete metanolo mostra un picco max di Abs a 515 nm ( colore viola intenso) Principio del metodo: Si assiste alla riduzione del radicale (DPPH •) in presenza di composti antiossidanti, con la successiva formazione di un composto stabile non radicalico (DPPH – H). L’aggiunta di antiossidanti determina la decolorazione della soluzione che vira dal viola intenso al giallo e, la riduzione di assorbimento

31 Determinazione dell’ attivita’ antiossidante lipofila :
Preparazione della soluzione – radicale: viene preparata una soluzione di DPPH• in presenza di metanolo ( tale soluzione è stabile solo per 12 ore) Determinazione dell’ attivita’ antiossidante lipofila : allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in eppendorf e al buio bianco C1 C2 C3 Metanolo (μl) 30 / DPPH• solution (μl) 970 si va a leggere l’Abs iniziale (A0) Sample (μl) I campioni (C) usati nel saggio sono i surnatanti (S6) di natura lipofilica precedentemente estratti Agitazione blanda per minuti a T ambiente e al buio Misura dell’Abs finale (A finale )

32 (%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100
Retta di calibrazione: lo standard utilizzato per la costruzione della retta di calibrazione è Trolox in metanolo (20 mM): analogo della vitamina E (equazione della retta y = a x) L’ attività antiossidante è valutata come diminuzione di Abs a 515 nm e, più precisamente espressa come % di inibizione del radicale (DPPH • ) secondo l’equazione : (%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100 Sostituendo i valori di % di inibizione all’incognita ( y ) nell’equazione della retta e, dividendo per i grammi di tessuto fresco, ricaviamo l’attività antiossidante liposolubile espressa in termini di ( mM/gr tessuto fresco)

33 5^ METODO: metodo ABTS Il cromogeno 2 2 azinobis (ABTS) reagendo con potassio persolfato genera un catione radicalico ABTS+• di colore blu/verde con un picco max di assorbimento a 734 nm Il metodo è applicabile allo studio sia dell’attività antiossidante lipofila sia dell’attività antiossidante idrofila Principio del metodo: L’attività antiossidante è valutata come riduzione di assorbimento a 734 nm del catione radicalico ABTS+• in presenza di antiossidanti

34 Preparazione del catione radicalico (ABTS+• ):
Preparazione della retta di calibrazione (equazione della retta y = a x) : Lo standard usato è il TROLOX (20 mM) in metanolo per il calcolo dell’attività antiossidante lipofilica Lo standard usato è l’ACIDO ASCROBICO in acqua per il calcolo dell’attività antiossidante idrofilica Preparazione del catione radicalico (ABTS+• ): acqua distillata, ABTS e una soluzione acquosa di persolfato di potassio ( la soluzione ottenuta va conservata al buio, a temperatura ambiente e conservata per 2 giorni )

35 si va a leggere l’Abs iniziale (A0)
Determinazione dell’ attivita’ antiossidante lipofila : allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in eppendorf e al buio bianco C1 C2 C3 Etanolo (μl) 50 / ABTS+• solution (μl) 950 si va a leggere l’Abs iniziale (A0) Sample (μl) I campioni (C) usati nei saggi sono i surnatanti (S6) di natura lipofilica e surnatanti (S3) di natura idrofila precedentemente estratti Agitazione blanda per minuti a T ambiente e al buio Misura dell’Abs finale (A finale ) Determinazione dell’ attivita’ antiossidante idrofila : allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in eppendorf e al buio bianco C1 C2 C3 Acuqa (μl) 50 / ABTS+• solution (μl) 950 si va a leggere l’Abs iniziale (A0) Sample (μl)

36 (%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100
L’ attività antiossidante è valutata come diminuzione di Abs a 734 nm e, più precisamente espressa come % di inibizione del radicale (ABTS+• ) secondo l’equazione : (%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100 Sostituendo i valori di % di inibizione all’incognita ( y ) nell’equazione della retta ( Y = a X) e, dividendo per i grammi di tessuto fresco, ricaviamo l’attività antiossidante liposolubile espressa in termini di ( mM/gr tessuto fresco) Sostituendo i valori di % di inibizione all’incognita ( y ) nell’equazione della retta ( Y = a X) e, dividendo per i grammi di tessuto fresco, ricaviamo l’attività antiossidante idrosolubile espressa in termini di ( nM/gr tessuto fresco)