Valutazione di una tecnica analitica

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1 Valutazione di una tecnica analitica
Accuratezza  capacità di determinare il valore vero Precisione  capacità di replicare le misure Sensibilità  capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicine Limite di rivelabilità  concentrazione minima di analita che può essere rivelata Range dinamico lineare  range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineare Concentrazione Segnale Selettività  capacità di distinguere tra due analiti Effetti matrice  effetti di altre componenti del campione sulla risposta analitica

2 Tecniche cromatografiche
In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC) In base al meccanismo di separazione Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico Esclusione Affinità

3 Schema delle tecniche Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

4 Tecniche cromatografiche
analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici  Gascromatografia analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica

5 Gascromatografia Gas-liquido supporto inerte solido
liquido non volatile, legato covalentemente meccanismo di ripartizione moltissime applicazioni Gas-solido fasi stazionarie di silice, allumina o carbone meccanismo di adsorbimento adatta per la separazione di gas permanenti (H2, He, Ar, O2, N2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione

6 Schema di un GC

7 Colonne per gascromatografia
Colonne impaccate contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida Colonne capillari WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

8 Stationary Phases Must have: (1) low volatility (2) thermal stability
(4) chemical inertness (5) solvation properties giving suitable values for k’, a. Commonest are polysiloxanes: Nature of R varied to give different polarities. e.g. All R = Me : non-polar column. Best for non-polar analytes (hydrocarbons, PAH’s etc.) or R = 50% Me, 50% cyanopropyl - increased polarity - best for alcohols, acids etc. Greater polarity from polyethylene glycols:

9 Confronto tra colonne impaccate e capillari
Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

10 Sample Introduction (continued):
A sample can be introduced in several ways, the most common being with a direct insertion probe or by infusion through a capillary column. Samples are often introduced using a direct insertion probe or a capillary column. The probe and capillary carry the sample into the vacuum of the mass spectrometer. Once inside the mass spectrometer, the sample is exposed to the ionization source

11 Injector Syringe Detector Gas tank Column Oven

12 Injector A GC syringe penetrates a septum to inject sample into the vaporization camber Instant vaporization of the sample, 280 C Carrier gas transports the sample into the head of the column Purge valve controls the fraction of sample that enters the column

13 Splitless (100:90) vs. Split (100:1)
Injector Syringe Purge valve open closed He He GC column GC column

14 Split or splitless Usually operated in split mode unless sample limited Chromatographic resolution depends upon the width of the sample plug In splitless mode the purge valve is close for s, which means the sample plug is seconds As we will see, refocusing to a more narrow sample plug is possible with temperature programming

15 Open Tubular Capillary Column
0.32 mm ID Mobile phase (Helium) flowing at 1 mL/min Liquid Stationary phase 0.1-5 mm 15-60 m in length

16 Oven Programmable Isothermal- run at one constant temperature
Temperature programming - Start at low temperature and gradually ramp to higher temperature More constant peak width Better sensitivity for components that are retained longer Much better chromatographic resolution Peak refocusing at head of column

17 General Elution Problem in GC
(a) - low temperature (450C) - good resolution initially - but too slow later. (b) - higher temperature (145oC) - much faster but poor resolution for early-eluting species. In general - best results for temperatures near boiling point of analyte. If there is a wide range of boiling points in the sample - then the best results \re obtained by temperature programming as shown in (c), for the same mixture, where the temperature steps are as shown.

18 Rivelatori per GC a conducibilità termica (TCD)
a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di elettroni (ECD) a conducibilità elettrolitica (ELCD) amperometrico per lo zolfo (ASD) termoionico (TID o NPD) fotometrico a fiamma (FPD) a fotoionizzazione (PID) ad emissione atomica (AED) a chemiluminescenza spettrometria di massa (MS) Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici (AED, ASD). Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa Un aspetto da considerare nella scelta del rivelatore è verificare se è distruttivo o no: nel secondo caso può essere interessante mettere in serie più rivelatori (es. TCD e MS)

19 Rivelatore a conducibilità termica
si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H2 ed He si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto la sensibilità è una delle peggiori è un sistema non distruttivo Campione Riferimento

20 Rivelatore a ionizzazione di fiamma
si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) non risponde a molecole volatili non infiammabili la sensibilità è buona è un sistema distruttivo

21 Rivelatore a cattura di elettroni
si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti all’uscita della colonna è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc.) la sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3H o 63Ni la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati è un sistema non distruttivo

22 Rivelatore a spettrometria di massa
accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenza è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali è un sistema distruttivo

23 Scelta del rivelatore La selezione è basata su:
natura chimica degli analiti potenziali interferenze limite di rivelabilità richiesto disponibilità e/o costo

24 Confronto tra rivelatori
Rivelatore Target LOD Range lineare TCD non selettivo 1 ng 106 FID idrocarburi 100 pg 107 ECD alogeni 50 fg Cl 104 ELCD composti di N, S, Cl 1 pg ASD composti di S 10 ppb S NPD composti di N, P 10 pg FPD composti di S, P 103 PID idrocarburi aromatici, eterocomposti 2 pg benzene AED elementi 0.1 – 20 pg/s Chem composti di N, S MS specie 10 ng (SCAN), pg (SIM) 105

25 Cromatografia liquida

26 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.)
Scambio ionico (Ion exchange chromatography) Gel filtrazione (Size-exclusion chromatography) Affinità (Affinity chromatography) Sulla base della carica netta (+ o -) nelle fasi precoci, ma non solo La risoluzione dipende: - dalla “capacità della resina (porosità) - dal pH dell’eluente - dal pI delle proteine da separare Requisiti strumentali da semplici a sofisticati (per caduta, FPLC e sue evoluzioni) Separa sulla base delle dimensioni molecolari Utilizzo nelle fasi tardive di una purificazione La risoluzione dipende: -dalla lunghezza della colonna -dalle proprietà della resina - materiale (silice, gel) - granulometria - porosità - resistenza (rigidità) - dal volume del campione caricato Requisiti strumentali da semplici a sofisticati (per caduta, FPLC, HPLC) Sulla base di affinità molecolari nelle fasi precoci La risoluzione dipende: - dalla “capacità” della resina (porosità) - dalla sua affinità Requisiti strumentali semplici o nessuno (per caduta, batch)

27 Schema di un HPLC

28 Selezione della tecnica HPLC

29 IL PICCO CROMATOGRAFICO
Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. tR viene misurato nel punto di massimo del picco; Wb viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base Wh è la larghezza del picco misurata al 50% dell’altezza Wi è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso

30 A fase mobile A fase stazionaria
PIATTI TEORICI Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi. La teoria dei piatti considera il sistema cromatografico come un sistema statico in equilibrio. Ciascun analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria. Ciascuno di questi equilibri definisce un piatto teorico A fase mobile A fase stazionaria I quattro concetti importanti per capire ed ottimizzare le condizioni separative sono: k’ Fattore di capacità  Selettività N Efficienza del sistema (numero di piatti teorici) R Risoluzione

31 EFFICIENZA SEPARATIVA
Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per questo è utile ricavare l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), che generalmente si esprime in millimetri. lunghezza della colonna in mm L’efficienza è tanto più elevata quanto minore è H e maggiore è N. Il concetto di piatto è usato nella distillazione frazionata, dove si considera che ogni stadio di condensazione/evaporazione avvenga su un diverso livello o piatto (questi piatti esistono effettivamente in molte colonne di distillazione) In cromatografia i piatti sono una rappresentazione teorica degli stadi di ripartizione (distribuzione) che le molecole incontrano durante il loro passaggio nel sistema separativo.

32 Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s. Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm (i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844 (ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5 m

33 FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA
Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale lungo la colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno sempre più larghi di quelli che escono prima. Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale.

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36 Random Elements to Motion
ß Random length of time that each molecule spends in the stationary phase ß Longitudinal diffusion: solute molecules tend to diffuse from more to less concentrated regions. Therefore some molecules move faster, some move slower than average in direction of flow ß Eddy diffusion: if the column is packed with particles of (or supporting) the stationary phase - there are many possibilities for differing routes down the column: All of these mechanisms have more time to operate, the longer the column. Hence increased line broadening down the column

37 LONGITUDINAL DIFFUSION
(MOBILE PHASE) Longitudinal diffusion in column chromatography is a band broadening process in which analytes diffuse from the concentrated center of a band to the more dilute regions ahead of and behind the band center. Toward and opposed to the direction of flow of the mobile phase. B is directly proportional to the diffusion coefficient, which is a constant equal to the rate of migration under a unit concentration gradient. The diffusion coefficients in liquids are orders of magnitude smaller than those in gases and therefore the role of the B term plays a small role on the band broadening in HPLC

38 MASS TRANSFER (Adsorption Kinetics)
Stationary phase mass transfer Mobile phase mass transfer

39 VAN DEEMTER EQUATION HETP = H = A + B/ + C
A - Multipath effect (Eddy diffusion) B/ - Longitudinal diffusion C - Mass transfer term

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42 Increased Efficiency In any method the object is to increase mobile phase / stationary phase interaction. Decrease particle size. Better packing – slower flow.

43 k’ (fattore di capacità) = (tR - tM) / tM = t’R / tM
FATTORE DI CAPACITA` Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: k’ (fattore di capacità) = (tR - tM) / tM = t’R / tM Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore è il fattore di capacità, più alto è il tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria e più tardi il composto eluisce. Il fattore di capacità è indipendente dalla velocità di flusso e dal sistema in generale. E`una funzione della capacità di ritenzione del sistema separativo accoppiata alle interazioni della fase mobile.

44 DIPENDENZA DEL FATTORE DI CAPACITA`

45 Column Resolution A quantitative measure of the ability of a column to separate two analytes, A and B: Defined as follows: Rs = 0.75 ® incomplete resolution Rs = 1.5 ® essentially complete resolution For Rs = 1.0, zone A contains 4% B and vice versa. For increased resolution use longer column - but (i) longer time & (ii) broader bands Usually compromise between resolution and speed of analysis

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47 The General Elution Problem
Mixture of 6 components with very different partition coefficients - hence very different elution times. In (a) - optimum for 1 & 2 - excessive time for 5 & 6. In (b) optimum for 5 & 6, but 1/2 & 3/4 not resolved. Solution - programme the elution so that the conditions start of as in (a), change to optimum for 3 & 4 (c), then finally as in (b). This can often give good resolution for a complex mixture in a reasonable time.

48 Eluizione isocratica o in gradiente
isocratica isocratica gradiente (più forte) (meno forte)

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52 Columns Usually stainless steel (to withstand pressure), mm diameter, ~5 mm packing. Very efficient but limited length (cf. GC) because of pressure drop. Packing - usually silica Stationary phase - could be involatile liquid (like those in packed-column GC). More usual now to use similar chemical species actually bonded to the silica (longer column life), e.g. R can be non-polar (C8 or C18 hydrocarbon chain) or polar (amine, nitrile etc.).

53 LA COLONNA CROMATOGRAFICA
Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

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57 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE NORMALE E IN FASE INVERSA Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

58 Normal-Phase HPLC Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel. Stationary Phase.: Silica (pH 2-8), Alumina (pH ), Bonded Diol, and NH2 Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl3) Applications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers. 30% Silica Gel 47% Silica based bonded phases Diol Amine Cyano 3% Alumina 20% Chiral Bonded Phases

59 Reversed-Phase HPLC 80% Octadecylsilica (ODS, C18)
Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore space + adsorption on the surface of bonded phase. Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C18, C8, C5, Phenyl, CN) Mobile phase: Methanol or Acetonitrile and Water. Applications: ~80% of all separations done on RP HPLC. 80% Octadecylsilica (ODS, C18) 10% Octylsilica (C8) 5% Butylsilica (C4) 3% Phenyl 2% Cyano (CN)

60 REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE
Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C18, C8, Phenyl, C4) Different sorption affinities between analytes results in their separation More polar analytes retained less Analytes with larger hydrophobic part are retained longer Almost no separation of structural isomers Nonspecific (hydrophobic) interactions are at least ten times weaker than polar small differences in component molecular structure could have a significant effect in their retention

61 Chromatography Stationary Phases
Silica Gel bulk (SiO2)x surface Derivatized Silica Gel Where R = C18H37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or “C18”) bulk (SiO2)x surface relatively polar surface relatively nonpolar surface “normal phase” “reversed phase”

62 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa.

63 FASE STAZIONARIA: CHIMICA DELLA SILICE
La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata.

64 FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE
OH FASE STAZIONARIA LIQUIDA La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. SUPPORTO SILICEO

65 FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE
Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura, espresso in mol/m2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. Si O OH

66 DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (ENDCAPPING)
I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di “end-capping” utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. Si O OH

67 FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA
In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

68 SCELTA DELLA FASE MOBILE
La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

69 SCELTA DELLA FASE MOBILE
Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

70 LA COLONNA CROMATOGRAFICA
Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

71 New Technology Monolithic Silica Columns

72 Traditional Silica "Particle-Based" Column
Individual silica particles High flow resistance: Limits ability to shorten run times High backpressure: Reduces life of pumps, seals, and column Reduced throughput: Long run times Bed splitting and voiding possible: Shortens column life and affects reproducibility, lowers efficiency Onyx™ “Monolithic” Column Monolithic porous silica rod High flow rates: Due to high porosity Low backpressures: Less stress on system and column Increased throughput: Significantly shorter run times No inlet bed settling: Increased reliability, reproducibility, and lifetime, maintains efficiency

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74 Injection Sample loop filling either done manually or by and autoinjector

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77 The Eluotropic Series

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79 Why use Trifluoroacetic Acid (TFA)?
Good detection sensitivity Good efficiency Good recovery Volatile mobile phase

80 ION SUPPRESSION R-COOH R-COO- + H+ ION PAIRING R-NH3+ -OOC-R
Molecola con gruppo carbonilico carico Molecola polare non carica ION PAIRING R-NH R-COO- R-NH3+ -OOC-R Coppia ionica Acido organico aggiunto all’eluente

81 Use of Polar (Acid) Modifiers in Peptide Separations
Aids in peptide solvation Suppresses ionization Provides ion pairing Preferably volatile for sample preparation and LC/MS

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83 Rivelatori per HPLC Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti Solute properties: si misura una caratteristica del soluto Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) Spettrofotometrico IR Fluorimetrico Indice di rifrazione (RID) Elettrochimico (ED) Spettrometria di massa (MS)

84 Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile
il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) basato sull’assorbimento di luce nel range UV-visibile sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) sensibilità tipica: 0.1 ppb è un sistema non distruttivo

85 Gruppi cromofori Cromoforo Formula lmax (nm) e aldeide -CHO 210 1.500
amino -NH2 195 2.800 azo -N=N- 3-25 bromuro -Br 208 300 carbossile -COOH 50-70 chetone -C=O 1.000 disolfuro -S-S- 194 5.500 estere -COOR 205 50 etere -O- 185 etilene -C=C- 190 6.000 fenile -C6H5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO2 270 12 nitrito -ONO nitrile -C=N 160 - nitro -NO2 forte

86 Scelta della lunghezza d’onda
La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: massimizzare sensibilità e specificità il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm) controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV operando sotto la lcutoff può: ridurre la sensibilità introdurre rumore sulla linea di base

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89 Rivelatore Diode-array
misura in ogni istante lo spettro UV-visibile dell’eluato nell’intervallo desiderato può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)

90 Confronto tra rivelatori
Rivelatore Target LOD Range lineare UV-visibile/ UV-DAD composti che assorbono luce UV-VIS 1 µg/l 104 IR Fluorimetrico composti policondensati (PAH) 10 ng/l 103 RID non selettivo 1 mg/l ELSD ED amperometrico composti elettroattivi 100 pg/l ED conducimetrico composti ionici MS specie 0.1 µg/l 105

91 MULTI-DIMENSIONAL SEPARATIONS: AN ALTERNATIVE TO 2-D PAGE
In multidimensional chromatography two (or more) techniques with “orthogonal” properties are combined to achieve higher separation power. MS FIRST DIMENSION: e.g. Size Exclusion, Ion-Exchange SECOND DIMENSION: e.g. Reversed Phase Ion-Exchange

92 FIRST DIMENSION: SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
Fraction collected every 30 sec. 69.5 83.0 minutes COLUMN: TSK 3000 SWxl (two)) SAMPLE: E. coli total protein extract MOBILE PHASE: Am. Acetate 200 mM (water/ACN 87:13) ml/min

93 ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY SECOND DIMENSION:
FRACTION 69.5 FRACTION 83.0 minutes SAMPLE: 30 sec. fractions collected after SEC COLUMN: weak anion exchange TSK-DEAE, NPR 4.6 x 50 mm MOBILE PHASE A: Amm. Ac M MOBILE PHASE B: Amm. Ac. 2 M both in water/ACN 4:1 GRADIENT: t0=20%B,t10= 20%B, t20=40%B

94 Colonne (precolonne*, colonne analitiche, le più diverse)
3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™ HPLC Columns Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nell’UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universale (rivela tutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono: rivelatore UV-vis rivelatore a fluorescenza rivelatore a indice di rifrazione (RI) * Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria 94

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