Fibrosi cistica La Fibrosi cistica, detta anche mucoviscidosi e’ un malattia genetica autosomica recessiva. E’ una malattia poco conosciuta anche se si.

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1 Fibrosi cistica La Fibrosi cistica, detta anche mucoviscidosi e’ un malattia genetica autosomica recessiva. E’ una malattia poco conosciuta anche se si tratta della più comune fra le malattie genetiche mortali nelle popolazioni di origine caucasica. Frequenza:1:200-1:6000 nati

2 Prevalenza portatori di 1/26 e 1/30
In Italia la prevalenza è compresa tra 1/2500 e 1/3000 tra i nuovi nati Prevalenza portatori di 1/26 e 1/30 In Italia, la prevalenza alla nascita è verosimilmente compresa tra 1/2500 e 1/3000, con una frequenza dei portatori compresa tra 1/26 e 1/30 2

3 Fibrosi cistica Nella sua forma più grave, la FC colpisce diversi organi, tra cui pancreas, polmoni, fegato, intestino Questa patologia si caratterizza per un'anomalia nel trasporto del cloro nella membrana delle cellule delle ghiandole a secrezione esterna. Di conseguenza queste ghiandole secernono un muco denso e vischioso e quindi poco scorrevole. Negli organi interessati, le secrezioni mucose, essendo anormalmente viscide, determinano un'ostruzione dei dotti principali, provocando l'insorgenza di gran parte delle manifestazioni cliniche tipiche della malattia, come la comparsa di infezioni polmonari ricorrenti, di insufficienza pancreatica, di steatorrea, di stati di malnutrizione, di cirrosi epatica, di ostruzione intestinale e di infertilità maschile; è una malattia molto grave. Il termine fibrosi cistica deriva dal tessuto cicatriziale che si forma nel pancreas

4 PATOFISIOLOGIA (I) Funzionamento anomalo della proteina CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance) che normalmente presiede ad alcune funzioni di trasporto di sali e di difesa contro le infezioni. Questo difetto comporta che le secrezioni degli organi siano dense e poco scorrevoli ristagnando ed occludendo dotti e canali, con danno progressivo degli organi interessati.

5 PATOFISIOLOGIA (II) Il pancreas si atrofizza e non libera i suoi enzimi digestivi (ad es. la tripsina), l’intestino si occlude,il fegato trattiene la bile, i bronchi si ostruiscono e si infettano Progressivamente compare il danno polmonare con infezioni ripetute fino all’infezione cronica che determina un’insufficienza respiratoria che è la causa principale di morte

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7 PATOFISIOLOGIA (III) Un tempo era considerata una malattia mortale dell’infanzia. Oggi il 50% dei pazienti supera I anni. Questo dato dipende da diversi fattori come la diagnosi precoce, il miglioramento delle cure,la diagnosi sempre più frequente di forme lievi. Il trapianto di polmone , diventato più frequente solo negli ultimi 10 anni, rappresenta un fattore decisivo per il prolungamento dell’aspettativa di vita nelle forme classiche gravi.

8 Rispetto ai casi descritti nel XVI secolo, la sopravvivenza mediana in CF è aumentata costantemente, da meno di 2 anni, nel 1938, a circa 30 anni nel 1989, quando il difetto genetico è stato scoperto, ad una mediana dell’ età di sopravvivenza del 41,7 anni nel 2015. Miglioramento della sopravvivenza in gran parte è stato determinato grazie alla comparsa di centri di cura specializzati, diagnosi precoce della malattia, allo screening tempestivo per le comorbidità associate ed alla realizzazione di terapie per ottimizzare la funzione polmonare e nutrizionale ed alla creazione di linee guida per la standardizzazione del trattamento in base ai sintomi

9 Screening neonatale per FC: razionale
1982 per la prima volta in Toscana Identificazione precoce della malattia Programma di cura prima che si manifestino i sintomi clinici: il decorso clinico della malattia è migliore nei pazienti diagnosticati precocemente Oggi la dx può essere effettuata mediante uno screening neonatale Possibilità di fornire alla coppia di un bambino affetto un’adeguata consulenza genetica

10 Screening neonatale per FC: metodo
Determinazione quantitativa della tripsina immunoreattiva (IRT) su una goccia di sangue prelevata in terza giornata Tale enzima è elevato nelle prime settimane di vita del bambino e poi diminuisce Nei casi sospetti il valore di IRT resta elevato a causa del reflusso di tripsina verso il torrente ematico per ostruzione dei dotti pancreatici Valori elevati di IRT si possono trovare anche in soggetti non affetti da fibrosi cistica. La lattasi può risultare elevata a causa della ridotta funzionalità pancreatica Si tratta di un test poco specifico dato che può dare numerosi falsi positivi e quindi lo si puo’ associare ad un altro test Per ridurre i casi di falsi positivi lo screening affianca il dosaggio della lattasi nel meconio

11 (Enzyme-linked immunoadsorbent assay)
Retesting I soggetti con valori elevati di IRT e lattasi sono sottoposti ad un nuovo test ad un mese di vita, tempo in cui i valori di tali enzimi si normalizzano Elisa (Enzyme-linked immunoadsorbent assay) ELISA è un acronimo che è derivata dall'espressione in inglese Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima). Si tratta di un versatile metodo d'analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima.

12 ELISA è un acronimo che deriva dall'espressione in inglese Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima). Si tratta di un versatile metodo d'analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima.

13 L’introduzione di questa tecnica ha consentito di effettuare una
VANTAGGI E SVANTAGGI DELLO SCREENING NEOANATALE SULLA FC L’introduzione di questa tecnica ha consentito di effettuare una diagnosi precoce Ampio numero di falsi positivi I soggetti con valori elevati di IRT e lattasi sono sottoposti al test del sudore che può essere effettuato non prima di giorni di vita del bambino

14 Test del sudore Misura la concentrazione del cloro e del sodio escreti nel sudore La diagnosi di FC viene effettata su due risultati positivi ottenuti in due giorni. Caratteristiche cliniche, storia familiare, età del paziente. Il test in assoluto più attendibile per la dx di FC è il test del sudore Le caratteristiche cliniche, la storia familiare e l’età del paziente devono essere tenute in considerazione per l’interpretazione globale dei risultati.

15 TEST DEL SUDORE Valori di riferimento >60 mEq/L test positivo
Sudorazione indotta da iontoforesi pilocarpinica: si stimola farmacologicamente la parte scelta. Misura della quantità di sudore e la concentrazione di cloro in essa presente Valutazione analitica Valori di riferimento >60 mEq/L test positivo 40-60 mEq/L borderline <40 mEq/L test negativo Stimolazione farmacologica del sudore

16 TEST DEL SUDORE Il test del sudore permette di stabilire la diagnosi nella maggioranza dei casi. In alcuni casi il suo significato resta comunque dubbio e l’esame deve essere ripetuto più volte.

17 Fibrosi Cistica:trasmissione
A A A a a A a a Ha una trasmissione autosomica recessiva I portatori hanno il 25% di rischio di avere figli affetti Maschi e femmine sono ugualmente affetti È dovuta all’alterazione di un canale del cloro, denominato CFTR (Cystic Fibrosis Conductance transmembrane regulator) Recessivo: l’allele mutato non si manifesta fenotipicamente se non quando su entrambi gli alleli è presente la mutazione in questione

18 La proteina CFTR Canale per il Cl- delle membrane apicali delle cellule epiteliali Appartiene alla famiglia dei trasportatori glicoproteici di membrana che possiedono siti intracellulari di legame per l’ATP (ABC-family)

19 DOVE STA CFTR? Nelle cellule epiteliali del polmone, del tratto digerente, ghiandole del sudore, sistema genitourinario

20 CFTR – IL CANALE DEL CLORO
2 metà omologhe Ogni metà ha 6 domini transmembrana 1 sito di legame per nucleotidi (NBD) collegati da un dominio regolatorio citoplasmatico (R-domain) che contiene i siti di fosforilazione

21 CFTR: FUNZIONE Trasporto epiteliale del Cl- L’efficienza del transporto epiteliale di Cl- è determinata dall’attivazione di CFTR che dipende dal suo stato di fosforilazione

22 Dalla mutazione alla malattia
La forma mutata del CFTR impedisce l’uscita del cloro, rendendo viscose le secrezioni Le secrezioni ostruiscono I dotti e alterano la funzionalità di pancreas ed intestino

23 CF: Genetica Gene CFTR localizzato sul cromosoma 7 (7q31-q32) 27 esoni
Oltre 2000 mutazioni: elevata variabilità allelica Alcune diffuse in tutto il mondo, altre sono specifiche di alcuni ambiti etnico-geografici Eterogeneità o variabilità allelica: più mutazioniu a carico dello stesso locus cromosomico

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25 Epidemiologia delle mutazioni CFTR in Italia

26 Spettro delle mutazioni CF
alterazioni funzionali/strutturali del CFTR F508: 70% alleli FC

27 Mutazioni gene CFTR Missenso 41.76 Frameshift 15.76 Splicing 12.71
Nonsenso 9.66 In frame in/del 2.01 Grandi in/del 2.85 Promotore 0.52 Variazioni di sequenza 14.59

28 LE MUTAZIONI Le mutazioni che colpiscono il gene possono essere suddivise in 3 gruppi: - mutazioni causanti la fibrosi cistica - mutazioni causanti le patologie CFTR-correlate - polimorfismi e varianti alleliche senza conseguenze cliniche Sulla base degli effetti provocati dalle mutazioni sul trascritto o sulla proteina finale è stato possibile suddividerle in 5 classi differenti:

29 LE MUTAZIONI La parziale riduzione della funzione (mutazione di classe III e IV) o la produzione di una proteina funzionante ma in quantità molto limitata (mutazione di classe V) danno un quadro clinico meno grave Per avere la forma classica della fibrosi cistica bisogna avere entrambi i geni ereditati che presentano una mutazione causante la fibrosi cistica

30 F508 Presente nel 70% dei pazienti
Delezione di un singolo aminoacido (fenilalanina in pos.508) nell’esone 10 che codifica per la prima parte del NBD-1 di CFTR Produce il misfolding di CFTR nel reticolo endoplasmico (ER) Questa proteina immatura viene degradata dal proteosoma il folding proteico rappesenta Il ripiegamento di proteine o ripiegamento proteico (in inglese protein folding) è il processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale che implica anche che esse sono attive dal punto di vista funzionale. Una volta mature e attive le proteine vengono rilasciate dal nucleo al reticolo endoplasmatico .

31 CF: F508 Mutazione più comune Etnia F508 frequenza
Afro-Americani 30% Ebrei Ashkenazi 37% Spagnoli/Italiani 50% Canadesi 70% Caucasici nord americani 76%

32 CF: Indicazioni al test genetico
Individui affetti Carrier test Partners di individui con CF Diagnosi prenatale

33 Tecniche di analisi genetica molecolare
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA Tecniche di analisi genetica molecolare Possiamo distinguere vari livelli di analisi molecolare che si caratterizzano per diversi tempi di esecuzione, tecnologie e costi. Vale la pena sottolineare che i test di I livello possono vantare una minore copertura ma consentono l’identificazione di mutazioni note,mentre quelli di II livello hanno una maggiore sensibilità, ma portano a risultati di più difficile interpretazione perché possono individuare sia mutazioni che portano alla malattia sia varianti che non sono patologiche. Screening di primo livello Screening di secondo livello Screening di terzo livello

34 SCREENING di PRIMO LIVELLO:
tipo di campione da cui partire Prelievo sangue venoso, o della mucosa buccale, villi coriali, liquido amniotico  Estrazione del DNA Multiplex PCR delle regioni geniche Ibridazione DNA con sonde allele specifiche RIVELAZIONE

35 SCREENING di PRIMO LIVELLO
Ricerca delle mutazioni più frequenti causative della fibrosi cistica mediante l’utilizzo di Kit diagnostici che sfruttano il principio della ibridazione allele-specifica (ASO).

36 Metodica Reverse dot blot
SCREENING di PRIMO LIVELLO: Metodica Reverse dot blot Le regioni del gene CFTR, dove sono localizzate le mutazioni da analizzare, sono amplificate simultaneamente mediante l’impiego di specifiche coppie di oligonucleotidi. Dopo la multilex PCR, l’amplificato viene denaturato e posto su una striscia di nitrocellulosa su cui sono presenti le sonde allele specifiche da testare. Tramite una reazione colorimetrica (biotina-streptavidina) si forma un precipitato scuro che permette di visualizzare, per ogni tratto di DNA, una o due bande colorate che consentiranno di stabilire la presenza o meno della mutazione testata e lo stato di omozigosi o eterozigosi

37 RDB - REVERSE DOT BLOT:ibridazione inversa degli acidi nucleici
Le sonde allele specifiche vengono fatte aderire stabilmente a una membrana di nylon. Dopo l’ibridazione tra le sonde e il DNA amplificato, nel quale è incorporato dUTP biotinilato, si procede alla visualizzazione colorimetrica con una reazionedi tipo biotina-streptavidina-fosfatasi alcalina.

38 Detection omozigote MM eterozigote NM omozigote NN

39 Kit Diagnostici

40 RDB MULTIPLO analisi di 36 mutazioni della Fibrosi Cistica (gene CFTR)

41 Le mutazioni identificate devono essere successivamente
confermate mediante sequenziamento diretto

42 Indagine prenatale di Fibrosi Cistica
(analisi diretta)

43 Analisi di II livello Quando?  per effettuare lo scanning dell’intero gene, ricercare qualunque tipo di mutazione in ampie porzioni del gene

44 ANALISI II LIVELLO PCR dei 27 esoni DHPLC 12 esoni a 57°C 15 esoni
Ex 1,3,4,8,13,14a,15, 16,18,19,20,22,23 Sequenziamento Ex 2,5,6a,6b,7,9,10,11, 12,14b,17a,17b,21,24 Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni e delle regioni limitrofe, riconoscimento di variazioni di sequenza, sequenziamento della specifica regione del gene. Le tecniche più utilizzate sono: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis e Denaturing High Performance Liquid Cromatography. I test di II livello permettono un tasso di individuazione (detection rate) migliore, ma il significato fenotipico del risultato molecolare può essere di difficile interpretazione. Per molte mutazioni CFTR le consegenze funzionali sono sconosciute si potrebbe trattare di polimorfismi. Inoltre questi saggi screenano per mutazioni presenti nelle regioni esoniche e nelle giunzioni esone/introne del gene CFTR. Mutazioni localizzate nel promotore o nelle regioni introniche sfuggono a questo tipo di analisi

45 Analisi di II livello: d-HPLC Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
Metodica che prevede di far eluire il DNA amplificato attraverso una colonna cromatografica in condizione di semidenaturazione. 1) Amplificazione del DNA 2) Denaturazione termica dei frammenti di DNA amplificati e loro ricombinazione 3) Formazione dei duplex “HETERODUPLEX”  combinazione di due catene di DNA a singola catena, non perfettamente corrispondenti, caratterizzata dalla presenza di una “bolla”, a livello della quale si trova il mismatch OMODUPLEX  combinazione di due catene di DNA a singola catena, perfettamente complementari: entrambi wt o entrambi mutati

46 Analisi di II livello: d-HPLC Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
La tecnica si basa sulla differente velocità di eluizione per gli eteroduplex e gli omoduplex L’eteroduplex è più veloce (meno trattenuto) degli omoduplex Vantaggi: maggiore sensibilità; notevole praticità e sicurezza nell’uso. Svantaggi: costo elevato

47 Analisi di III livello Quando?  per studiare le mutazioni che sfuggono al I e al II livello, quindi riarrangiamenti genici rari e le mutazioni introniche non adiacenti agli esoni e causanti alterazioni dello “splicing”

48 Analisi di III livello: MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification
Si basa sulla amplificazione, mediante PCR, delle SONDE che vengono aggiunte al campione Ogni sonda è costituita da 2 oligonucleotidi che ibridizzano sequenze adiacenti I due oligonucleotidi adiacenti vengono ligati solo in presenza del DNA target, permettendo la successiva amplificazione dell’intera sonda Tutte le sonde presentano sequenze terminali che permettono di amplificarle simultaneamente con una sola coppia di primer I prodotti delle diverse sonde vengono distinti sulla base della lunghezza e delle caratteristiche

49 Ibridazione & Ligazione
MLPA probemix è costituito da 43 sonde disegnate per ciascuno dei 27 esoni del gene e per geni di controllo Viene aggiunto al DNA genomico denaturato Ciascuna sonda ibridizza due sequenze adiacenti

50 Ibridazione & Ligazione
4. La ligazione delle sonde avviene tramite una ligasi termostabile

51 Amplificazione 5. Tramite una coppia di primer marcati vengono amplificate tutte le sonde ligate 1 2 3 35

52 Elettroforesi capillare
CFTR delex2,3

53 Diagnosi genetica … screening prenatale!
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA Diagnosi genetica … screening prenatale! E’ possibile eseguire sul liquido amniotico o sui villi coriali la ricerca delle mutazioni più frequenti che causano la FC (screening 34 o 48 mutazioni), che nel complesso permette di identificare circa l’85% dei casi di FC nella nostra popolazione. Cristiana Zollo M46621

54 LA DIAGNOSI PRENATALE nella FC
Nelle coppie a rischio Identificazione della mutazione nei genitori Ricerca della mutazioni parentali nel feto

55 Analisi Diretta I Livello: Reverse Dot Blot
- Analisi delle mutazioni più frequenti II Livello: - DHPLC - SEQUENZIAMENTO III Livello: MLPA

56 Analisi Indiretta Utilizzo della segregazione dei polimorfismi IVS8GT e IV17bCA etc che sono considerati come i più frequenti. Si vanno a valutare il numero di ripetizioni di questi polimorfismi Utilizzo della segregazione dei polimorfismi IVS8GT e IV17bCA che sono considerati come i più frequenti. Si vanno a valutare il numero di ripetizioni di questi polimorfismi

57 Cura Anche se attualmente nessuna cura è in grado di guarire completamente la Fibrosi Cistica, numerose terapie permettono di contrastare l’evoluzione della malattia, controllando le infezioni polmonari, fornendo un’alimentazione adeguata e prevenendo l’ ostruzione intestinale. Fisioterapia e riabilitazione respiratoria: per rimuovere dalle vie respiratorie il muco che le ostruisce e che favorisce le infezioni. Aerosolterapia: per fluidificare il muco o somministrare antibiotici per via aerea per controllare le infezioni respiratorie croniche. Antibioticoterapia: per bocca o per via endovenosa, a cicli o per periodi molto prolungati, anche in continuazione, per eliminare o contenere la carica e l'aggressività dei batteri. Il problema associato alla terapia genica è sempre quello legato alla possib. Di veicolare la copia corretta gel gene senza scatenare reazioni di rigetto da parte dell’organismo Nutrizione: alimentazione sostenuta, ipercalorica, ricca di grassi associata a somministrazione di enzimi pancreatici ad ogni pasto, in sostituzione di quelli che il pancreas non produce, e integrata da vitamine liposolubili.

58 Terapia genica La terapia genica mira nell’uso della forma normale del gene allo scopo di correggere il gene mutato causativo della malattia. Il goal sarebbe quello di sostituire il gene mutato nelle cellule del polmone per curare la malattia o per diminuirne la progressione. Vettori per trasferire la proteina: virus adenoassociati, liposomi, cellule staminali. Correzioni della funzionalità della proteina legata al suo cattivo ripiegamento. Aumento del numero dei canali del cloro funzionanti

59 Dagli USA primo ok al farmaco per i pazienti con mutazione F508del …
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA Dagli USA primo ok al farmaco per i pazienti con mutazione F508del … BOSTON, 13 maggio Una nuova e importante buona notizia per i pazienti affetti da fibrosi cistica. Dopo appena una settimana dall’introduzione sul mercato italiano di ivacaftor, il primo farmaco in grado di agire sulle cause della malattia, dagli USA è arrivato il primo parere positivo su un’altra terapia potenzialmente in grado di cambiare radicalmente le sorti della patologia … …Si tratta della combinazione di ivacaftor con lumacaftor (ORKAMBI), prodotta anche in questo caso da Vertex. La combinazione di farmaci ha dimostrato risultati incoraggianti per i pazienti con due copie della mutazione F508del nel gene CFTR. Noto come correttore del CFTR, lumacaftor ha lo scopo di trattare il difetto di elaborazione e trasporto della proteina F508del-CFTR al fine di permetterle di raggiungere la superficie cellulare dove il potenziatore del CFTR, ivacaftor, può ulteriormente migliorarne la funzione di canale ionico.. !

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61 Editing genetico LE NUOVE FRONTIERE DELL’INGEGNERIA GENETICA
Manipolare geni umani sarà dunque possibile? Editing genetico Tecnica di terapia genica in cui una specifica sequenza del DNA cellulare, definita “target”, è direttamente modificata. Introduzione all’interno delle cellule di una sequenza esogena di DNA, in grado di riconoscere in maniera specifica la sequenza target e apportare una specifica conversione. Il segmento di DNA esogeno ha una sequenza omologa alla sequenza bersaglio e differisce solo per l’alterazione genica (inserzione, delezione, sostituzione) da “introdurre” o da “correggere”.