transizione di fase: liquido - solido

Presentazione sul tema: "transizione di fase: liquido - solido"— Transcript della presentazione:

1 transizione di fase: liquido - solido
Cristallizzazione transizione di fase: liquido - solido Cristallo solido omogeneo e anisotropo caratterizzato da una disposizione regolare e ordinata di atomi/molecole nello spazio tridimensionale Soluzione acquosa di proteina Solido amorfo solido isotropo caratterizzato da una disposizione disordinata e casuale di atomi/molecole nello spazio (es. vetri)

2 Esempi di cristalli di proteine
A causa della struttura e simmetria interne, i cristalli assumono la forma di una figura solida delimitata da facce piane: poliedro

3 Caratteristiche dei cristalli di proteine
Ampi canali di solvente Una piccola frazione della superficie della proteina partecipa ai contatti intermolecolari Limitato livello di ordine Deboli interazioni tra le macromolecole all’interno del reticolo cristallino Alta fragilità e sensibilità alle condizioni esterne Variazioni di pH, temperatura, forza ionica… Dimensioni limitate Dimensioni lineari mm = molecole

4 Impacchettamento cristallino:
Canali di solvente è possibile diffondere piccole molecole nel cristallo

5 Lo stato cristallino è un problema ?
I cristalli di proteina hanno un contenuto di solvente > 30% Meno del 30% della superfice della proteina è coinvolta con interazioni proteina-proteina I cristalli di proteina possono essere pensati come soluzioni molto concentrate (~ 10 mM) Le proteine molto spesso cristallizzano in forme diverse. In generale le differenze sono piccole (~0.1 Å), o importanti (es. conformazioni multiple) Le strutture allo stato solido sono generalmente in accordo con quelle ottenute in soluzione da tecniche spettroscopiche (NMR) Molti enzimi sono attivi allo stato solido (studi di catalisi enzimatica con cristalli di proteina)

6 Requisiti necessari per la cristallizzazione
Purezza = assenza di contaminanti (>95%) Omogeneità = assenza di eterogeneità conformazionali (domini flessibili, equilibrio di conformeri, aggregazione, denaturazione…) ed eterogeneità di sequenza (frammentazione dovuta a proteasi, modifiche post-traduzionali…) Attività biologica – corretto folding Quantità (>10mg)

7 L’importanza della purificazione
Il collo di bottiglia della cristallizzazione Struttura cristallina Impurità nelle Proteine : Rendono i cristalli disordinati Fermano la crescita dei cristalli I cristalli non si formano This illustration shows that the typical stacking arrangement of the unit cells in a crystal structure.

8 Come si induce la cristallizzazione?
Transizione di fase: liquido - solido  Solubilità (cs): massima concentrazione del soluto in un dato solvente ad una data T  equilibrio tra soluto disciolto e soluto indisciolto.  Sovrasaturazione (cp/cs)  non-equilibrio; la concentra- zione del soluto (cp) è maggiore della sua solubilità (cs)

9 Stadi del processo di cristallizzazione
1) Nucleazione: formazione dei primi aggregati ordinati stabili  elevata sovrasaturazione 2) Crescita  Può avvenire in zona di nucleazione ma è più favorita in zona metastabile a minore sovrasaturazione, dove non si ha formazione di nuclei. 3) Cessazione della crescita Studi sul lisozima indicano che i nuclei stabili presentano una dimensione critica dell’ ordine di circa 30-40 molecole

10 Per passare dalle molecole libere in soluzione alla formazione di nuclei di cristallizzazione corrispondenti ad un intermedio ad alta energia bisogna superare una barriera energetica che determina la cinetica del processo McPherson, Alexander; Editor. Crystallization of Biological Macromolecules. (1999)

11 DIAGRAMMA di FASE Salting in Salting out
zona Labile REGIONE SOVRASATURA zona Metastabile Curva di Solubilità Equilibrio termodinamico concentrazione proteina (mg/ml) Salting in Salting out REGIONE NON SATURA Concentrazione precipitante (es. [sale]) curva di solubilità =saturazione equilibrio liquido-solido

12 “La bellezza non è tutto” Ciò che conta è il diagramma di diffrazione!
Questi cristalli che sono belli da vedere purtroppo non diffrangono i raggi-X. Quello che si vede al microscopio è la superficie del cristallo i raggi-X “vedono” l’ordine interno (bulk) del cristallo Questi cristalli che sono particolarmente brutti dal punto di vista morfologico diffrangono invece molto bene i raggi-X. C’e’ un buon ordine interno del cristallo anche se la superficie è molto irregolare Ciò che conta è il diagramma di diffrazione! La diffrazione è prodotta dal volume e non dalla superficie del cristallo

13 Principali parametri chimico-fisici che influenzano
la cristallizzazione delle proteine Concentrazione della macromolecola Concentrazione e natura dell’agente precipitante (alcoli, sali, polimeri PEG,…) pH del tampone Additivi Temperatura Moti convettivi Forza di gravità

14 Precipitanti Modificano i contatti proteina-proteina e proteina-solvente in modo che: le molecole di proteina si associno per formare i cristalli SALI SOLVENTI ORGANICI POLIMERI Deidratano la proteina (salting out) Riducono la costante dielettrica Effetti di esclusione di volume Come i Sali, competono per l’acqua Come i solventi organici, riducono la costante dielettrica

15 Precipitanti SALI SOLVENTI ORGANICI POLIMERI
Solfati (SO42-) NH4+, Li+, Na+, Ca2+, Cd2+, Mg2+ Alogenuri (F-,Cl-, Br-,I-) NaCl, NaBr, NaI, NaF, CaCl2 Fosfati (PO43-) Na+,K+ Acetati (CH3COO-) NH4+, Na+ …………. Alcoli MPD (2-metil-2,4 pentan diolo) Etanolo Butanolo Isopropanolo Glicerolo Glicoletilenico DMSO (dimetilsolfossido) ………… PEG (polietilenglicole a vari PM medi) Poliammine Jeffamine (poliossoalchil-ammine) ………..

16 Precipitanti usati nelle cristallizzazioni
Statistica dati 1995 da Biological Macromolecule Crystallization Database (BMCD) NASA MPCD : Marseille Protein Crystallization Database

17 Metodi di cristallizzazione
Diffusione in fase vapore (Hanging - Sitting Drop) Microbatch Dialisi Diffusione libera all’interfaccia

18 Diffusione in fase vapore
(Hanging - Sitting Drop) Sistema chiuso: [ goccia di (proteina + agente precipitante) + agente precipitante + aria ] evolve verso l’equilibrio attraverso l’evaporazione dell’acqua dalla goccia al reservoir. Hanging Drop Sitting Drop

19 Diffusione in fase vapore
(Hanging - Sitting Drop)

20 Rallentamento dell’evaporazione
Chayen (1998) J. Appl. Cryst. 30,

21 Accelerazione dell’evaporazione della goccia
Saridakis and Chayen (2000) Prot. Sci. 9,

22 Piastre per la cristallizzazione

23 Ottimizzazione delle condizioni in linbro plate
1 6 2 3 4 5 7 8 9 A B C D pH 4.6 pH 5.0 pH 5.5 NaCl 5% % %… Cristallo “ideale” Micro-cristalli a cluster Precipitato Precipitato cristallino Cristalli piccoli

24 Batch  Diretto mescolamento di proteina + agente precipitante per raggiungere istantaneamente le condizioni di sovrasaturazione  Natura “statica” dell’esperimento: le concentrazioni dell’agente precipitante e della proteina non variano Microbatch sotto olio olio +1ml prot. +1ml prec. Questo metodo è facilmente automatizzato e prevede l’utilizzo di piccole quantità  screening

25 Batch CA CB CC

26 Vantaggi nella Cristallizzazione in Microbatch sotto Olio
Le gocce nel metodo Hanging drop si possono allargare sulla superfice del vetrino a causa dei solventi o detergenti che diminuiscono la tensione superficiale. Cosa che non avviene nel microbatch sott’olio E’ il più semplice metodo meccanico di cristallizzazione che lo rende adatto a studi HTP automatizzati da robot Volumi molto piccoli fino a pochi centinaia di nl Crystalli posso essere cresciuti controllando il processo di nucleazione in diversi modi: Scegliendo l’olio Variando lo spessore della fase olio Applicando il metodo senza contenitore con doppio strato d’olio …..

27 Cristallizzazione senza contatto con il contenitore usando due oli non miscibili a diversa densità
Chayen (1996) Prot. Eng. 9,

28 Problemi Associati con la Cristallizzazione Microbatch
Nucleazione Shock Uso di componenti organiche Stabilizzazione dei cristalli Montaggio dei cristalli

29 Conversione dal metodo di diffusione di vapore al microbatch
La concentrazione dei precipitanti e della proteina è normalmente più bassa nel microbatch.

30 Dialisi  La composizione della soluzione è alterata per diffusione
di composti a basso peso molecolare attraverso una membrana semipermeabile La concentrazione della proteina non cambia durante la cristallizzazione precipitante proteina membrana Il precipitante diffonde lentamente nella soluzione di proteina

31 Dialisi  E’ possibile ottenere piccoli incrementi di
concentrazione di precipitante per successivi trasferimenti in soluzioni diverse  La stessa prova di cristallizzazione può essere riciclata cambiando le condizioni esterne fino a quando non si ottengono i cristalli

32 I bottoni per Dialisi variano dai 7 ai 200 ml.
Difetti: non si possono usare soluzioni di PEG; difficoltà nell’osservare i cristalli

33 diffusione libera all’ interfaccia
L’esperimento può essere fatto in capillari da ~0.1mm di diametro dove i moti convettivi sono ridotti. Possono essere utilizzati speciali capillari a basso assorbimento di raggi X-ray (capillari Lindeman) In capillari di vetro Prot. E’ una tecnica che produce un gradiente temporale e spaziale di super-saturazione lungo il capillare Crist. Prec. (sale)

34 Diffusione libera all’interfaccia
 La nucleazione avviene all’interfaccia dove la sovrasaturazione è massima  Mentre la proteina ed il precipitante diffondono l’una nell’altro i nuclei più piccoli si sciolgono e quelli più grandi continuano a crescere

35 Fattori presenti nella Nucleazione
Concentrazione di precipitanti, proteina, additivi e pH Temperatura Cinetica del processo di cristallizzazione Seeding Crescita epitassiale Pareti del contenitore Superfici cariche Fattori meccanici: pressione, vibrazioni Campi elettrici, magnetici e gravitazionali

36 Metodi per l’ottimizzazione
Optimization of crystal growth: two extremes of technology 1. Crystals in space vs. 2. Cat whiskers for seeding experiments Why do we shoot crystals into space? To eliminate sedimentation and convective flow in the crystallization solutions. There is no convective mixing therefore space, diffusive transport dominates. a quasi stable depletion zone around the xtl.Acts as a diffusion filter vs. incorporation of large impurities (I.e. other proteins and aggregates of the nutrient molecules.) microgravità Seeding

37 Micro-seeding Si tocca un Cristallo o una soluzione che contiene dei microcristalli fratturati Pelo Si traccia una linea nella goccia

38 Macro- seeding Si introduce un piccolo cristallo nella soluzione

39 FILTRAZIONE DELLE SOLUZIONI
NON filtrare nel processo di screening per redurre l’eccesso di nucleazione Filtrare quando si otimizza per una maggiore riproducibilità Filtrare nel processo di seeding

40 Metodi di Screening Incomplete factorial screen Random screen
Le numerose variabili presenti nel processo di cristallizzazione definiscono uno spazio multi-dimensionale dove il campionamento sistematico è praticamente impossibile Incomplete factorial screen Random screen Sparse matrix screen ……………..

41 Incomplete Factorial Screen
Il campionamento fattoriale incompleto modifica alcuni variabili, come pH, precipitanti, T, etc., simultaneamente e casualmente. Approcci statistici rigorosi portano ad una prima scelta casuale dei valori delle variabili (fattori) e poi questi vengono bilanciati in modo da raggiungere un campionamento uniforme nello spazio multi-dimensionale considerato Un approccio difficile da applicare senza l’uso di robot e di software specifici.

42 Random screen Lo spazio a N-dimensioni del processo di cristallizzazione viene campionato completamente a caso senza considerare delle conoscenze a priori CRYSTOOL 50 reagenti, 90 solutioni premescolate Il sistema opera automaticamente Robot e software dedicati Segelke J. Crystal Growth 232, (2001); Rupp J. Structural Biology 142, (2003)

43 distribuzione della frequenza dei reagenti
Distribuzione della frequenza dei reagenti in 203 esperimenti casuali positivi di cristallizzazione. Il detergente LDAO (laurildimetilamine-N-ossido) e il glicerolo appaiono essere degli additivi importanti come alcuni precipitanti tipo PEG-MME 5k e PEG 6k

44 E’ il metodo più utilizzato!
Sparse Matrix Screen Il campionamento a matrice sparsa introduce intenzionalmente un bias utilizzando combinazioni di condizioni che hanno dato risultati positivi nelle precedenti cristallizzazioni di proteine E’ il metodo più utilizzato! NON necessita di robot anche se sistemi automatici di screening possono aiutare Jankarik & Kim, J. Appied Crystallography 24, (1991)

45 Kit Commerciali Hampton Research Molecular Dimensions deCODE genetics
JenaBioscience ………………

46 Structural genomics Alcuni consorzi lavorano a ritmi di 10 proteine/giorno risolvendo 400 strutture in 5 anni Cristallizazione High throughput mediante robot e software specifici

47 Screening mediante robots

48 Problemi nel dispensare piccolissimi volumi:
Inacuratezza Evaporazione Problemi risolti con: Robotica Dispensando e incubando sotto olio (Micro batch)

49 Dispensare gocce sotto olio
L’incubazione sotto olio protegge la nucleazione da contaminanti presenti nell’aria Chayen (1997) Structure 5,