Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Presentazione sul tema: "Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale"— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale
Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche nelle famiglie affette Caratterizzazione clone genomico Ricerca di mutazioni nucleotidiche Ricerca funzione proteica

2 Clonaggio funzionale L’identificazione del gene e della sua posizione nel genoma avviene a partire dalla conoscenza della proteina Se la proteina è nota si frammenta in peptidi e si determina la struttura amminoacidica Dalla sequenza amminoacidica si deduce la possibile sequenza codificante, considerando la degenerazione del codice

3 Esempio di clonaggio funzionale del gene per il fattore VIII
della coagulazione Sonde degenerate corrispondenti a una porzione di sequenza amminoacidica del fattore VIII. Ibridazione con cloni di una libreria di cDNA ; il clone di cDNA isolato si usa come sonda per individuare un clone in una libreria di DNA genomico

4 Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale
Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche nelle famiglie affette Caratterizzazione clone genomico Ricerca di mutazioni nucleotidiche Ricerca funzione proteica

5 MARCATORI GENETICI Un marcatore genetico è paragonabile ad un cartellino colorato che serve a “marcare” i cromosomi degli individui in un pedigree. Un marcatore genetico per essere tale deve essere polimorfico ed i suoi diversi alleli possono essere utilizzati per seguire la segregazione di alleli per un altro gene quando si effettuano incroci.

6 MARCATORI GENETICI Caratteristiche: Trasmissione mendeliana Neutralità
Elevato livello di polimorfismo Tipizzazione facile ed economica Posizione nota nel genoma

7 TIPI DI MARCATORI POLIMORFICI
- Polimorfismi immunologici (es: gruppi sanguigni, rilevabili con tecniche sierologiche) - Polimorfismi genetici a livello proteico (rilevabili attraverso l’elettroforesi ed altre tecniche di caratterizzazione degli isozimi) - Polimorfismi genetici a livello del DNA

8 POLIMORFISMO GENETICO
VARIABILITA’ GENETICA SEMPLICE POLIMORFISMO: presenza di 2 o più fenotipi alternativi (morfi) a trasmissione mendeliana MORFI: generalmente determinati da alleli diversi ereditati in modo mendeliano POLIMORFISMO GENETICO Carattere monogenico presente in una popolazione con una frequenza  1% ETEROZIGOSITA’ (H) f(A) = p f(B) = q H = 2pq H aumenta in relazione al numero di alleli del locus

9 TIPI DI MARCATORI GENETICI NELL’UOMO
Tipo di marcatore n° loci Caratteristiche Gruppi sanguigni  20 sangue fresco, dominanza Varianti proteiche  30 siero fresco, saggi specialistici, polimorfismo limitato RFLP del DNA > alleli, eterozigosità massima 0,5 1975- VNTR del DNA >104 Molti alleli, altamente informativi (minisatelliti) 1985- VNTR del DNA >105 Molti alleli, altamente informativi (microsatelliti) 1989- SNP del DNA >106 Meno informativi dei microsatelliti 1998-

10 LIVELLO DI POLIMORFISMO
- Eterozigosità - Contenuto d’informazione del polimorfismo (Polymorphism Information Content = PIC) TASSO DI MUTAZIONE Singola Sostituzione Nucleotidica (SNS):  10-9 Variable Number of Tandem Repeat (VNTR): minisatelliti  microsatelliti  Il genoma è un serbatoio potenziale di polimorfismi così vasto da consentire di individuare i marcatori più adatti per affrontare un ampio spettro di problematiche della genetica delle popolazioni umane.

11 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI
1 2 Analisi della segregazione degli alleli per il locus A e degli alleli del locus B Dalle meiosi di II-1 è possibile stabilire: 5 combinazioni parentali e 2 ricombinanti Dopo quante meiosi si può stabilire se i loci A e B sono associati o indipendenti?

12 LA MAPPATURA GENETICA PRIMA DEI MARCATORI MOLECOLARI DEL DNA
Gruppi di associazione tra loci (marcatori proteici) noti e loci responsabili di malattie: ABO - adenilatochinasi ABO - sindrome unghia- rotula Duffy - cataratta congenita Rh - ellissocitosi Collinesterasi - transferrina Lutheran - secretore G6PD - emofilia G6PD - daltonismo A3 Y A1 /A2 D D/d c daltonico * enzimopenico c * Locus Daltonismo: D = allele normale; d = allele daltonismo A2 Y A1 Y A2 Y d d D Locus gene G6PD: A2 = allele normale; A1 = allele enzimopenia G6PD

13 MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE
A) NON INFORMATIVA A1 A1 A2 A2 A1 A2 Gli alleli del marcatore in omozigosi nel padre non possono essere distinti B) NON INFORMATIVA A1 A2 La figlia può aver ereditato A1 dal padre e A2 dalla madre o viceversa

14 MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE
C) INFORMATIVA La figlia ha ereditato A1 dal padre (fratria A1 A1 alternativa a A1 A2 della famiglia B) A1 A2 A1 A1 D) INFORMATIVA La figlia ha ereditato A1 dal padre A1 A2 A3 A4 A1 A4

15 UNA MEIOSI E’ INFORMATIVA, OVVERO UTILE PER GLI STUDI DI ASSOCIAZIONE (LINKAGE), QUANDO SI PUO’ IDENTIFICARE LA FASE DEI 2 LOCI E QUINDI STABILIRE SE IL GAMETE E’ O MENO RICOMBINANTE PERCHE’ LA MEIOSI SIA INFORMATIVA IL GENITORE DEVE ESSERE DOPPIO ETEROZIGOTE PER I DUE LOCI Es: genotipo locus malattia: Allele normale (+)/ Allele mutato (-) genotipo locus marcatore: A1/A2 +/- A1/A2

16 Marcatore Alleli (Frequenze H PIC alleliche)
A (tutti = 0,1) , ,891 X (0,5; 0,5) , ,5 X (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0, ,75

17 MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI
1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ………

18 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI
1 2 Dalle meiosi paterne: i loci A e B sono indipendenti o associati? Non si possono classificare II-2 e tutti gli individui della III generazione rispetto a II-2 (omozigote A1A1B1B1)

19 Sacchetto con monete di tre possibili tipi: TT (monete con T su entrambe le facce), oppure TC, oppure CC 4 lanci: T, T, T, T E’ possibile capire da che tipo di monete è fatto il sacchetto? Ipotesi che siano CC = Scartata Ipotesi possibili: A: che siano TT B: che siano TC Se non si fossero fatti lanci Ipotesi A: Ipotesi B 1:1 Si intende per VEROSIMIGLIANZA di un’ipotesi A, rispetto ad una serie di fatti che costituiscono il risultato R, la probabilità con cui si sarebbe verificato R se A fosse stata vera.

20 Si confrontano le VEROSIMIGLIANZE di tutte le ipotesi per accertare se una è risultata MOLTO PIU’ VEROSIMILE delle altre Verosimiglianza dell’Ipotesi A = 1 (che siano TT) Verosimiglianza dell’ipotesi B = (1/2)4 = 1/16 1 Rapporto = 16 :1 1/16 Quanti lanci bisogna fare prima di assumere che siano TT? Si decide una soglia per 2 motivi: 1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona un’ipotesi che invece è sbagliata; 2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame

21 UN ESEMPIO DI CALCOLO DI LOD SCORE
Caso in cui II 1 ha fase nota NR R R R R R R R Probabilità di meiosi ricombinante =  Probabilità di meiosi non ricombinante = (1- ) Probabilità 5 NR e 1R = (1- )5 x 1 Probabilità totale in assenza di associazione = (0,5)6 = (1/2)6 Rapporto della verosimiglianza = (1-)5 x  1 / (1/2)6 Calcolo del log10 degli ODD (1-)5 x  1 Lod score Z = log (1/2)6  , , , , ,5 Odd , , , , Z  0, , , ,

22 LE CURVE DEI LOD SCORE Z = lod score 1000
Z = log = (p=0,05) 1 Z > 3 EVIDENZA DI LINKAGE Z = log = - 2 100 Z < - 2 ESCLUSIONE DI LINKAGE 3 > Z > - 2 NON CONCLUSIVI PER IL LINKAGE SENZA RICOMBINANTI MASSIMO DI LOD SCORE E’ PER  = 0 INTERVALLO DI CONFIDENZA (95%): LOD SCORE - 1 es. curva 2 max lod score = 3.7 per  = limiti fiduciali:

23 COME SI OTTENGONO I VALORI DEL LOD SCORE
Per ogni famiglia si calcola: - la verosimiglianza ‘a posteriori’ (sulla base del risultato osservato nelle meiosi) per una serie di ipotesi di associazione (linkage), cioè di valori di ricombinazione  il valore che si ottiene per ciascun  dell’ODD ratio (= verosimiglianza dell’ipotesi  / verosimiglianza dell’ipotesi di indipendenza) il Logaritmo degli ODD (= LOD) - i calcola il Lod score complessivo sommando quello di ogni singola famiglia per ogni  - si costruisce il grafico dei Lod score e si individua il valore di  per cui la verosimiglianza è massima

24 Lod score Z = log10 --------------------- (1/2)6
(1-)5 x  1 Lod score Z = log (1/2)6  , , , , ,5 Z  0, , , ,

25 Z = log10 --------------------- + --------------------- (1/2)6 (1/2)6
(1-)5 x  (1-) 1 x  5 Z = log (1/2) (1/2)6 NR NR NR NR NR R R R R R R NR  , , , , ,5 Z  0, , , ,

26 MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI
1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ………

27 MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI ......
5) Nel caso di meiosi non informative non è possibile stabilire con certezza gli individui ricombinanti e non ricombinanti e quindi se i due loci sono associati 6) Estensione della tipizzazione a più famiglie Come si stabilisce se i due loci sono associati? 7) Analisi dell’associazione tra il marcatore ed il locus attraverso il calcolo del lod score per ogni singola famiglia 8) Valutazione del lod score complessivo e utilizzazione del criterio statistico per decidere l’associazione o l’esclusione di associazione

28 STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI
1 2 Rispetto alla combinazione parentale (II-1): 5 NR, 2 R Frequenza di ricombinazione = 2/7 = 28,6%

29 QUESTO E’ STATO OTTENUTO CON:
IL LINKAGE A DUE O PIU’ PUNTI E’ ESSENZIALE PER LA COSTRUZIONE DELLE MAPPE MARCATORE - MARCATORE QUESTO E’ STATO OTTENUTO CON: - COLLEZIONE DI FAMIGLIE CON STRUTTURA IDEALE RACCOLTE A QUESTO SCOPO DAL CEPH DI PARIGI (CENTRE POUR L’ETUDE DES POLYMORPHISMES HUMAINES): 40 famiglie con 3 generazioni e almeno 6 figli) - ANALISI DI MARCATORI POLIMORFICI (SOPRATTUTTO MICROSATELLITI) LOCALIZZATI SU TUTTI I CROMOSOMI IN FAMIGLIE CEPH (1998: mappati 8325 loci microsatelliti) ED ISTITUZIONE DI UNA BANCA DATI - DETERMINAZIONE DELL’ORDINE DEI LOCI NELLE MAPPE MARCATORE – MARCATORE E DEFINIZIONE DELLE DISTANZE IN CENTIMORGAN

30 ESEMPIO DI FAMIGLIA CEPH

31 IL PROGETTO GENOMA UMANO
PER LA MAPPATURA DEL GENOMA UMANO SONO STATI UTILIZZATI NUMEROSISSIMI MARCATORI POLIMORFICI (RFLP E VNTR), NON NECESSARIAMENTE CORRELATI A GENI ESPRESSI, CON MODALITA’ DI TRASMISSIONE MENDELIANA Utilizzi: 1) Mappatura genetica di loci sconosciuti responsabili di malattie genetiche; 2) Clonaggio genico; 3) Diagnosi prenatale e presintomatica. 23 GRUPPI DI ASSOCIAZIONE (22 AUTOSOMI E CROMOSOMA X)

32 STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI NEL CROMOSOMA 12
% Ricombinazione 3 5 2 Analisi della segregazione degli alleli nelle famiglie CEPH. Lod score a due o più punti per stabilire associazione tra marcatori e stimare la distanza genetica in percentuali di ricombinazione che equivalgono ai cM. 1% ricombinazione = 1 unità di mappa = 1 centiMorgan (cM) Totale % ricombinazione convertito in 133 cM e quindi in Mb

33 STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA
Stima della distanza genetica totale nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica attraverso meiosi di origine paterna o materna = 2644 cM (maschio) = 4481 cM (femmina) Per 3000 Mb = 3 x 109 bp di genoma Maschio cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp Femmina cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

34 Il tasso di ricombinazione non è identico lungo il cromosoma

35 La distribuzione dei ricombinanti lungo il cromosoma non è casuale e dipende dal sesso
Distribuzione dei chiasmi negli spermatociti (blu) e negli oociti (rosso)

36 Mappatura genetica Mappatura fisica bassa risoluzione Mappatura fisica alta risoluzione Mappatura del trascritto Sequenziamento del gene

37 Esempio di analisi di associazione tra marker M e malattia AD
Stima della frequenza di ricombinazione = 2/6 = 0,33

38 L’associazione è tra loci !
Associazione (linkage) tra il locus marcatore A e locus ignoto di una Malattia Autosomica Dominante in 3 famiglie con la stessa patologia A1 A2 A2 A3 A3 A2 A2 A3 D d d D d d d d A1 A2 A2 A3 A1 A3 A3 A2 A3 A3 A2 A3 D d d d D d D d D d d d A2 A4 A2 A3 D d d d L’associazione è tra loci ! A2 A2 A4 A3 A2 A3 A4 A2 D d d d D d d d

39 Distrofia Muscolare di Duchenne Acondroplasia
MALATTIE PER LE QUALI E’ STATO IDENTIFICATO IL GENE CAUSATIVO TRAMITE CLONAGGIO POSIZIONALE Corea di Huntington Fibrosi cistica Distrofia Muscolare di Duchenne Acondroplasia Tumore del seno (BRCA1, BRCA2) Malattia del rene policistico Atassia spinocerebellare di tipo I, etc Distrofia miotonica Poliposi familiare del colon

40 ESEMPIO DI CLONAGGIO POSIZIONALE: L’INDIVIDUAZIONE DEL GENE BRCA1
Frequenza tumore al seno in Inghilterra: 1 su 12 donne Casi familiari per mutazione BCRA1 1994: clonaggio di BRCA1. Gene responsabile dell’80-90% dei casi di famiglie affette sia da tumore mammario che alle ovaie. Tumor suppressor gene, mutato anche in altri tipi di cancro 1995: clonaggio di BRCA2. Frequente anche nei casi di tumore mammario nei maschi Comunque solo il 20-25% dei tumori mammari familiari dovuti a questi 2 geni: altri geni con effetto modesto? (eredità poligenica)

41 Distribuzione di marcatori associati sul cromosoma 1 e distanza in cM