ESERCITAZIONI ANTROPOLOGIA POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Presentazione sul tema: "ESERCITAZIONI ANTROPOLOGIA POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)"— Transcript della presentazione:

1 ESERCITAZIONI ANTROPOLOGIA POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2 RACCOLTA CAMPIONE BIOLOGICO
Procedura per la raccolta di cellule della mucosa buccale Procedura per la raccolta saliva

3 ESTRAZIONE DEL DNA Diverse metodiche che variano per tempi e quantità di DNA estratto Fenol-cloroformio Salting out Kit di estrazione Salting out procedure

4 PREPARAZIONE DELLA PCR
1 – Campione di DNA 2 - Primers (filamenti di DNA sintetico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA) 3 – Nucleotidi 4 – Taq polimerasi (è un enzima per la polimerizzazione degli acidi nucleici. In particolare la Taq polimerasi proveniente dall'organismo termofilo Thermus aquaticus) 5 – Mix buffer (può variare in base al protocollo, nel nostro caso un tampone + MgCl2) 6 - Provette da PCR

5 REAZIONE PCR

6

7 ELETTROFORESI è una tecnica separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso

8 Caricamento dei campioni
ELETTROFORESI Gel in cui sono stati praticati i pozzetti per la semina di campioni Caricamento dei campioni I campioni sono evidenziati agli UV La fluorescenza è ottenuta mediante una molecola intercalante capace di inserirsi nella doppia elica del DNA e di renderlo visibile agli UV (Cyber green)

9 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
RFLPs restriction fragment length polymorphism, polimorfismo da lunghezza dei frammenti di restrizione Enzimi di restrizione Elettroforesi SEQUENZIAMENTO (SANGER) determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico. Elettroforesi mediante sequenziatore VNTR Variable Number of Tandem Repeat, Polimorfismi di lunghezza per le ripetizioni in tandem Elettroforesi mediante sequenziatore

10 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
RFLPs L’enzima di restrizione o endonucleasi taglia il DNA in corrispondenza di una sequenza specifica. Se nella sequenza in questione un nucleotide muta, l’enzima non riconosce più la successione nucleotidica e non può tagliare la doppia elica

11 RFLPs Enzima di restrizione 300 bp 120 bp 180 bp 300 BP 180 BP 120 BP
G C T A C G A T 120 bp 180 bp 300 bp 300 BP 180 BP 120 BP

12 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
RFLPs

13 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
SEQUENZIAMENTO ABI PRISM 310 Sequenziatore di DNA ABI Prism 3700

14 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
SEQUENZIAMENTO Elettroferogramma

15 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
VNTR Si definiscono VNTR sequenze costituite da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem GATA Unità di ripetizione 7 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 6 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 8 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC

16 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
GATA Unità di ripetizione Tracciato elettroforetico + 8 rip. Individuo 1 ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 7 rip. 7 rip. ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC Individuo 2 ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 5 rip Individuo 1 Individuo 2 -

17 UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR
+ Tracciato elettroforetico 8 rip. 7 rip. 7 rip. 5 rip Individuo 1 Individuo 2 -

18 UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE
Molecola circolare di 16569bp 37 geni (13 proteine, 22 tRNA, 2rRNA) Regione codificante Regione di controllo (Hrv 1 e 2)

19 UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE
APLOTIPO Combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento cromosomico contenente loci strettamente associati tra loro ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTGCACTAGGCAGA Aplotipo 1 Aplotipo 2

20 UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE
APLOGRUPPO gruppo di aplotipi di cui si ipotizza un’origine comune, grazie alla condivisione di mutazioni caratteristiche (generalmente ad evoluzione lenta) Aplogruppo mtDNA Si definisce sulla base della condivisione di mutazioni specifiche in posizioni con un basso tasso di mutazione (stabili) Aplotipi non identici possono appartenere allo stesso aplogruppo

21 UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE

22 UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE
Sequenza di Anderson (1981) “sequenza di riferimento di Cambridge”

23 (MIX) QUANTITA’ PER CAMPIONE
PROTOCOLLO PCR mtDNA (MIX) QUANTITA’ PER CAMPIONE H2O 19,5 μl Tampone 2,5 μl MgCl2 0,75 μl Nucleotidi (A-T-C-G) 0,5 μl Primer forward Primer reverse Taq polimerasi 0,25 μl 1) MOLTIPLICARE PER IL NUMERO TOTALE DEI CAMPIONI 2) DISPENSARE 24 μl DI MIX IN OGNI PROVETTA DA PCR 3) AGGIUNGERE 2 μl DI DNA AD OGNI PROVETTA DA PCR