ELETTROFORESI Tecnica di separazione di molecole cariche (ioni) in un campo elettrico. Gli ioni carichi positivamente (cationi) migreranno verso il polo.

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1 ELETTROFORESI Tecnica di separazione di molecole cariche (ioni) in un campo elettrico. Gli ioni carichi positivamente (cationi) migreranno verso il polo negativo (catodo) e quelli carichi negativamente (anioni) migreranno verso il polo positivo (anodo). Per ogni pH diverso dal punto isoelettrico (pI) le proteine portano una carica netta e possono quindi migrare in un campo elettrico. pH < pI pH = pI pH > pI

2 + - - + Una proteina mostra carica elettrica = 0 ad un pH = pI
3 4 5 6 7 8 pH 9

3 ELETTROFORESI Il campo elettrico (E) è generato applicando una ddp V tramite due elettrodi posti ad una distanza d. L’intensità del campo elettrico è dato da E = V/d La forza che agisce sulla molecola di carica q è uguale a Eq. La velocità della particella è data da: Vel = Eq / f f è il coefficiente frizionale = 6prp La mobilità elettroforetica (m) di uno ione è data da vel/E ossia dal rapporto tra la velocità dello ione e l’intensità del campo elettrico Vel = mE La velocità di migrazione dipende dalla mobilità dello ione e dall’intensità del campo elettrico m = q/(6prp) La mobilità dello ione dipende dal numero di cariche, dal raggio dello ione e dalla viscosità del mezzo

4 - - - - - catodo (-) anodo (+)
La velocità di migrazione aumenta all'aumentare della carica netta del campione. La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso molecolare e della viscosità del mezzo Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche. - - - - - catodo (-) anodo (+) Più le particelle sono grandi e pesanti, minore è la loro velocità. Maggiore è la loro carica, maggiore è la loro velocità

5 Legge di Ohm Legge di Joule I = intensità di corrente V = voltaggio
R = resistenza I = V/R V = IR Legge di Joule Potenza sviluppata W = VI W = I2 R Nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene principalmente trasportata dagli ioni del tampone. Gli ioni del campione ne conducono solo una piccola parte La maggior parte di questa potenza vene dissipata sotto forma di calore

6 Strumentazione L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta, fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una cella elettroforetica . L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+)

7 ELETTROLISI Durante l'elettrolisi, al catodo si producono ioni OH- e idrogeno, mentre all'anodo si producano H+ e ossigeno. Reazione al CATODO (basico) 2H2O + 2e-  H2 + 2OH- HA  A- + H+ Reazione all’ANODO (acido) H2O  ½ O2+2H+ +2e- A- + H+  HA Gli OH-, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA) della miscela tampone e ciò provoca un aumento della formazione di A- che conduce corrente all'anodo. All’anodo, gli ioni A- si combinano con gli ioni H+ per riformare HA e vengano forniti elettroni al circuito elettrico.

8 GEL DI POLIACRILAMMIDE.
L’elettroforesi viene comunemente condotta utilizzando matrici di supporto, come carta, nitrocellulosa, gel di agarosio, amido e poliacrilammide. GEL DI POLIACRILAMMIDE. % T = % (g acril + g bis) % C = 100 (g bis)/ (g acril + g bis)

9 GEL DI POLIACRILAMMIDE
La polimerizzazione è catalizzata da TEMED (N,N,N,N’-tetrametilendiammina) e APS (ammonio persolfato). Il TEMED catalizza la formazione di radicali liberi dal persolfato, che innescano la polimerizzazione. L’inserimento occasionale di bis-acrilammide fa sì che venga introdotto un nuovo punto di attacco per l’estensione della catena

10 SISTEMA CONTINUO Gli stessi ioni sono presenti nel campione, nel gel e nel tampone di corsa a pH costante (anche se con diversa concentrazione) Il campione viene stratificato direttamente sul “separating gel”

11 SISTEMA DISCONTINUO Ioni diversi sono presenti nel gel e nel tampone di corsa, con pH diversi. Il campione viene caricato in uno “STACKING GEL” a maglie larghe (% acrilammide = 4-5%) sopra il “SEPARATING GEL” a maglie più strette (% acrilammide = 7-15%) Tampone di corsa: tris-glicina pH 8,3 ione mobile: glicina- Stacking gel: tris-HCl pH 6,7 ione mobile: Cl- Separating gel: tris-HCl pH 8,9 ione mobile: Cl-

12 Glicina = acido debole. Poche molecole sono presenti come Gly-.
STACKING GEL Tampone Ioni Cl- , ioni guida Ioni glicina-, ioni di trascinamento pH = 6.7 Glicina = acido debole. Poche molecole sono presenti come Gly-. HCl = acido forte. Presenza elevata di Cl-. Mobilità tot = mobilità specie x fraz. carica x ddp Se aumenta ddp, la mobilità di una specie poco mobile può uguagliare quella di una molto mobile. La ddp è inversamente proporzionale alla conducibilità. Sotto l’azione del campo elettrico la mobilità delle proteine è intermedia tra quella del Cl- e quella della glicina- Le proteine migrano come banda compatta tra gli ioni guida (Cl-) e quelli di trascinamento (glicina-) Il Cl- lascia dietro di sé una zona a bassa conducibilità, e qui la ddp aumenta, perrchè le due grandezze sono inv proporzionali. Quindi anche la gly- che è meno dissociata ha una mobilità elevata perché trova alta ddp e quindi alla fine si muove alla stessa velocità del Cl-

13 La glicina- migra immediatamente dopo gli ioni Cl-
Ioni glicina- ioni di trascinamento Ioni Cl- ioni guida SEPARATING GEL pH = 8.3 L’aumento del pH determina un aumento nel grado di dissociazione della glicina e quindi della sua mobilità. La glicina- migra immediatamente dopo gli ioni Cl- Inoltre le minori dimensioni delle maglie del separating gel operano come un setaccio molecolare che rallenta le proteine. Le proteine migreranno quindi in funzione della carica e della massa.

14 ELETTROFORESI NATIVA Separa le proteine in funzione di carica e massa. Conserva la struttura terziaria e quindi l’attività biologica delle proteine

15 Le proteine sono costituite da amminoacidi
Le proteine sono costituite da amminoacidi. In natura esistono 20 differenti amminoacidi. VALINA La STRUTTURA PRIMARIA consiste nella sequenza amminoacidica che costituisce il polipeptide. Esempio: MET-THR-TYR-LYS-LEU-ILE-LEU-ASN-GLY-LYS- THR-LEU-LYS-GLY-GLU-THR-THR-THR-GLU-ALA- VAL-ASP-ALA-ALA-THR-ALA-GLU-LYS-VAL-PHE- LYS-GLN-TYR-ALA-ASN-ASP-ASN-GLY-VAL-ASP- GLY-GLU-TRP-THR-TYR-ASP-ASP-ALA-THR-LYS- THR-PHE-THR-VAL-THR-GLU STRUTTURA SECONDARIA ALFA ELICA FOGLIETTO BETA La STRUTTURA TERZIARIA consiste nella struttura tridimensionale delle proteine

16 Elettroforesi nativa (PAGE) delle PEROSSIDASI ANIONICHE di foglie di pioppo (Populus deltoides x maximowiczii, clone I-214, res, e Eridano, sens) esposte a 60 ppb di ozono per 5 ore al giorno per 15 giorni (O3) o ad aria filtrata (C). C O3 C O3 RES SENS

17 ELETTROFORESI DENATURANTE O SDS-PAGE
Separa le proteine in funzione della massa. Prevede l’utilizzo di un agente denaturante (SDS) che dissocia le proteine nei polipeptidi individuali e di un agnte riducente ( mercapto etanolo, urea) che rompe i ponti disolfuro L’SDS si lega alle proteine in rapporto costante (1,4 g per ogni g di proteina) conferendo un uguale densità di carica negativa ai complessi SDS-polipeptide che in tal modo migrano solo in funzione della massa. + - cariche delle catene laterali - SDS

18 Esempio di utilizzo dell’SDS-PAGE per determinare il peso molecolare di polipeptidi mediante l’utilizzo di standard a peso molecolare noto. Standard Campione Il peso molecolare di un polipeptide è inversamente proporzionale alla sua mobilità. Il peso molecolare può essere stimato direttamente dal grafico semilogaritmico (o logaritmico) del peso molecolare di proteine standard vs la loro mobilità.

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