PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI

Presentazione sul tema: "PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI"— Transcript della presentazione:

1 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI
METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante (An*) per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i + An* KAn* An*-Ab

2 ELISA understanding the acronym
EL Enzyme-Linked An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the presence/amount of a protein of interest. The enzymatic reaction will produce a colored species.

3 ELISA understanding the acronym
EL Enzyme-linked IS Immunosorbent An antibody or antigen (“immuno”) is adsorbed (“sorbent”) onto the polystyrene wells in which we conduct the test.

4 ELISA understanding the acronym
EL Enzyme-linked IS Immunosorbent A Assay We could determine the amount of (quantitative assay). We will use concentration standards to construct a standard curve.

5 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter
In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

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9 384 wells 1536 wells

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20 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

21 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione SATURAZIONE Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

22 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

23 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

24 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

25 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

26 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

27 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

28 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI
Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita

29 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI
Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

30 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Antigene Enzima Incubazione Tracciante Anticorpo di rivelazione Aggiunta del tracciante Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

31 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” SATURAZIONE Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

32 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

33 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

34 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

35 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

36 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

37 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

38 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
DIRETTI INDIRETTI

39 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + + Ab anti-ferritina marcato con HRP Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione

40 Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

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42 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Anticorpo Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo specie-specifico Incubazione Substrato enzimatico Lavaggio Antigene di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

43 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Saturazione Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

44 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

45 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

46 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

47 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

48 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

49 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

50 STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO
Rivelazione mediante un anticorpo secondario marcato Marcatura diretta Ab anti-specie X marcato Ab ottenuto nella specie X Streptavidina marcata Ab anti-specie X biotinilato Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile con un opportuno reagente Ab ottenuto nella specie X

51 COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA
IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA biotina avidina enzima MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

52 The Global Pregnancy Testing Market was valued
$1121 million in 2015 and estimated to reach $ 1410 million by 2020 growing at a CAGR of 4.7 %. Pregnancy tests are tests used to detect the presence of reproductive hormones such as Follicle Stimulating Hormone or Luteinising Hormone. Fertility rapid test kits help to find the exact day of ovulation or confirm the presence of menopause in women where as they are used to detect the sperm count.

53 DISPOSITIVI LATERAL FLOW
I dispositivi lateral flow (LFD), spesso denominati “strip”, sono metodi analitici immunocromatografici. I reagenti si trovano normalmente incorporati nel dispositivo, rendendo le strip idonee per un’analisi da campo, grazie alla loro praticità d’uso da parte di chiunque e in qualunque situazione. Sono spesso meno precisi di altre metodiche di screening basate su saggi immunologici come gli ELISA, ma possono essere sufficientemente sensibili, quantitativi ed accurati quando appoggiati ad un sistema di lettura strumentale.

54 Un tipico LFD è formato da
un sample pad dove viene deposto il campione un conjugate pad in cui è adsorbito il tracciante, una membrana dove avviene la reazione di legame del saggio sul quale ci sono due siti attivi, uno per il test e uno di controllo, ed infine da un absorbent pad responsabile del direzionamento del flusso attraverso la membrana. 

55 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay
Negativo Positivo Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

56 Lateral flow test, IMMUNOSTRIP
Control line. Antibodies anti-IgG adsorbed Test line. Antibodies anti-antigen adsorbed Antibodies anti-antigen conjugated with enzyme

57 Lateral Flow test, IMMUNOSTRIP
The antibodies are binded to their antigen in the sample and the complex antigen-antibody moves by capillarity towards the reaction lines.

58 Lateral Flow test, IMMUNOSTRIP
Antigen binds to the antibodies that are in the test line. Free antibodies bind to the antibodies anti-Ig present in the control line.

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61 LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY
DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:    - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:    - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:    - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO Conformità direttiva 98/79/CEE