EMOPOIESI L’emopoiesi rappresenta l’insieme dei processi cellulari tesi alla formazione degli elementi figurati del sangue.

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1 EMOPOIESI L’emopoiesi rappresenta l’insieme dei processi cellulari tesi alla formazione degli elementi figurati del sangue.

2 L’ENTITA’ DEL FENOMENO EMOPOIESI
In condizioni normali, ogni ora sono prodotti: 1010 globuli rossi 109 globuli bianchi In condizioni di stress (perdita acuta di sangue, infezione) i fabbisogni aumentano di 10 volte e oltre Inoltre le cellule prodotte dal midollo sono in grado di funzionare in tutti i distretti dell’organismo in modo autonomo 24 ore/24 per tutta la vita

3 L’emopoiesi prenatale è, a sua volta, suddivisa in 4 fasi:
Nei vertebrati lo sviluppo delle cellule del sangue avviene in due fasi: una fase embrionale transitoria e una successiva fase definitiva. Queste fasi differiscono per i siti in cui gli elementi del sangue vengono prodotti, per la tipologia delle cellule prodotte e per i tempi necessari all’emopoiesi. L’emopoiesi prenatale è, a sua volta, suddivisa in 4 fasi: 1 20 40 60 80 100 CELLULARITA' (%) NASCITA ETA' MILZA FEGATO SACCO VITELLINO MIDOLLO OSSEO TIBIA FEMORE COSTOLE STERNO VERTEBRE PRENATALE POSTNATALE Epatica Mieloide Mesoblastica Splenica

4 Periodo epato-splenico
(12a settimana) Umbilical cord Spleen Yolk Sac Adult bone marrow Fetal liver Periodo midollare (20a settimana) Periodo epatico (6a settimana) Periodo mesoblastico (sacco vitellino) Ontogenesi dell’Emopoiesi

5 Feto 0-2 mesi Sacco Vitellino (mesoblastica)
SITI DELL’EMOPOIESI Feto mesi Sacco Vitellino (mesoblastica) 0-8 mesi Fegato, Milza (epatica, splenica) 5-9 mesi Midollo Osseo (mieloide) Bambini Adulti Il midollo osseo rosso si trova in tutte le ossa (canale midollare) fino alla pubertà, poi viene lentamente sostituito da midollo osseo giallo Il midollo osseo rosso, attivo, si trova soprattutto nelle estremità delle ossa lunghe , fra i due tavolati delle ossa piatte (sterno, coste, scapole) e a livello delle ossa del bacino. Adulto Bambino 5

6 MIDOLLO OSSEO Il midollo osseo si situa nelle nicchie delimitate dalle
trabecole della spongiosa ossea. Il midollo osseo è un tessuto da gelatinoso a semifluido.

7 TESSUTO EMOPOIETICO Nella cavità del tessuto spugnoso e nella cavità midollare è contenuto il midollo osseo rosso, con funzione emopoietica, e il midollo osseo giallo (prevalentemente cellule adipose)

8 CELLULE STAMINALI Sono cellule non specializzate caratterizzate da due fondamentali proprietà che le definiscono e differenziano da tutte le altre cellule: La capacità di autorinnovarsi mediante divisioni cellulari da cui si originano cellule identiche alla cellula madre La capacità di differenziare dando origine a cellule specializzate

9 CLASSIFICAZIONE DELLE CELLULE STAMINALI
- TOTIPOTENTI PLURIPOTENTI MULTIPOTENTI UNIPOTENTI DIFFERENZIAMENTO +

10 CELLULE STAMINALI

11 LE CELLULE STAMINALI CELLULE CAPACI DI DIVIDERSI (AUTORINNOVAMENTO) PER TUTTA LA VITA DI UN ORGANISMO IN DETERMINATE CONDIZIONI SONO IN GRADO DI DIFFEREN- ZIARSI DANDO ORIGINE ALLE CELLULE MATURE DI UN OR- GANISMO; IN BASE AL POTENZIALE DIFFERENZIATIVO POSSONO ESSE- RE DISTINTE IN: TOTIPOTENTI  LO ZIGOTE (UOVO FECONDATO) PLURIPOTENTI  LE CS EMBRIONALI (da cui deri- rivano le cellule del MESODERMA ECTODERMA, ENDODERMA) MULTIPOTENTI  LE CS DELL’ADULTO

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13 PROPRIETA’ DELLA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA:
capacità di “self-renewal” capacità di dare origine a progenitori multipotenti capacità di dare origine a precursori “committed” (differentiation plasticity) Capacità di engraftment Plasticità (developmental plasticity) La cellula staminale emopoietica

14 PLASTICITA’ DELLE CELLULE STAMINALI

15 MICROAMBIENTE MIDOLLARE
Componente vascolare Cellule reticolari (istiociti) Struttura nervosa Adipociti, fibroblasti, Macrofagi Cellule stam. mesenchimali Componente cellulare Fibre reticolari/collagene Prolungamenti cell. reticolari Proteine d’adesione proteoglicani Matrice extracellulare

16 IL MICROAMBIENTE EMOPOIETICO
Il microambiente (nicchia emopoietica) è composto da una multitudine di cellule stromali ed emopoietiche che forniscono: Superfici Matrice extracellulare Fattori solubili che in concerto sono responsabili della regolazione e proliferazione, quiescenza, differenziazione, reclutamento ed accumulo dei progenitori emopoietici e delle cellule staminali. Le funzioni della nicchia emopoietica sono diverse: Fornire uno spazio anatomico Istruire le cellule ad autorinnovarsi (stretto rapporto con il microambiente) o a differenziarsi (lontano dalle cells stromali) Influenzare la mobilità cellulare.

17 STRUTTURA DEL MIDOLLO OSSEO
Cavità compartimentalizzate da trabecole ossee, contenenti cellule stromali (adipociti, fibroblasti, macrofagi) e cellule emopoietiche (eritroblasti, granuloblasti, megacariociti), con un complesso sistema vascolare (arteriole midollari e corticali, rete sinusale, seno centrale) ed una specifica matrice extracellulare che fornisce una rete strutturale a cui le cellule stromali ed emopoietiche possono ancorarsi. VASCOLARIZZAZIONE Il sistema vascolare è permeabile alle cellule ematiche mature per la presenza di pori di migrazione beanti sulla parete sinusale (passaggio per processo "attivo").

18 MIDOLLO OSSEO IMMISSIONE IN CIRCOLO DEGLI ELEMENTI MATURI

19 La normale funzione del midollo dipende da:
1. Normalità del microambiente midollare specifico 2. Normale funzione delle CELLULE STAMINALI 3. Vit. B12, acido folico, ferro+ormoni, proteine+lipidi +zuccheri 19

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21 CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE
Circa lo 0.1% di cellule nucleate del midollo sono quiescenti e considerate pluripotenti. Per mitosi generano una cellula pluripotente (autorinnovamento) e una cellula staminale dalle quali origineranno le cellula progenitrici (multipotenti) - CFU-GEMM precursore della linea mieloide - CFU-Ly precursore della linea linfoide CFU= unità formanti colonie

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23 Fasi dell’emopoiesi Cellula Staminale Automantenimento Orientamento
Mieloide Linfoide DIFFERENZIAZIONE Eritroblasti Granuloblasti Megacariociti B T Monoblasti MATURAZIONE linfociti eritrociti granulociti piastrine B maturi T maturi monociti

24 QUALI SONO I FATTORI CHE FAVORISCONO L’EMOPOIESI?
- Il microambiente che si forma in nicchie specifiche adatte al differenziamento delle diverse linee ematiche - Il contatto con la matrice extracellulare - I fattori di crescita emopoietici

25 I FATTORI DI CRESCITA I fattori di crescita sono glicoproteine prodotte dalle cellule stromali, dalle stesse cellule emopoietiche, dal fegato e dal rene. Funzioni: - Sono stimolatori dell’emopoiesi per il continuo rinnovo delle cellule ematiche (condizioni normali) - Stimolano la produzione di leucociti, eritrociti e piastrine in caso di infiammazione, anemia, trombocitopenia (condizioni di stress)

26 LE CELLULE MESENCHIMALI (STROMALI)
Fibroblasti, mio-fibroblasti, adipociti, osteoblasti, cellule endoteliali e macrofagi Citochine solubili Osteoblasti Cellula staminale Macrofago Citochine di membrana Fibroblasti Cellula endoteliale Trabecola ossea CSF,HGF, ILs

27 SINTESI ED EFFETTI Molte citochine sono prodotte dalle cellule stromali del midollo ; agiscono a livello midollare e spesso anche in siti ben precisi e specifici. I fattori di crescita agiscono: - inducendo la proliferazione dei progenitori emopoietici - attivando le cellule mature - stimolando le funzioni delle cellule mature - stimolando la produzione di altri HGF

28 CSF, HFG, IL - Il termine Colony Stimulating Factor (CSF) è un termine generico utilizzato per indicare sostanze capaci di stimolare la crescita di colonie ematopoietiche - Il termine Hematopoietic Growth Factor (HGF) indica specifici fattori capaci di agire a diversi livelli. - Il termine Interleukina (IL), originariamente indicava molecole che erano necessarie per le interazioni fra cellule dell’immunità. Oggi con questo termine si indica una classe di molecole attive nella cascata emopoietica, appartenenti alla famiglia delle citochine., che agiscono soprattutto sui leucociti.

29 PRODUZIONE ENDOGENA EPO: eritropoietina TPO: trombopoietina
La EPO fornisce l’esempio più chiaro per quanto riguarda la produzione endogena di fattori emopoietici, in quanto si conosce il sito esclusivo di produzione (apparato iuxtaglomerulare del rene) La TPO fornisce un altro esempio riguardante il rapporto fra livelli sierici e produzione di piastrine ed è la citochina regolatrice della produzione piastrinica (sintetizzata soprattutto dal fegato). EPO: eritropoietina TPO: trombopoietina

30 Emopoiesi patologica milza fegato esofago polmone cervello
In presenza di patologie, i siti extramidollari possono servire come siti primari per lo sviluppo delle cellule ematiche Siti ematopoietici fetali (milza e fegato) possono diventare siti primari nell’adulto in alcune malattie (anemia mediterranea) b. Siti midollari adulti, che sono normalmente non ematopoietici (cervello, polmoni, esofago), possono trasformarsi in siti ematopoietici per aumentare la produzione di cellule del sangue o per presenza di malattie neoplastiche fegato esofago polmone cervello

31 EMOPOIESI Il midollo osseo è sede prevalentemente di proliferazione e maturazione delle cellule del sangue , ma può fungere anche da deposito. Infatti: Granulociti: il midollo funge da compartimento di proliferazione e maturazione ma anche da deposito  midollo sede di maturazione e deposito Eritrociti: nel midollo avviene la maturazione ma non il deposito di globuli rossi perché la loro funzione è di agire da vettori di ossigeno e anidride carbonica midollo come sito di maturazione, non di deposito Megacariociti: nel midollo c’è la maturazione. Il 70% delle piastrine circola nel sangue, il restante 30% è depositato nella milza, fegato midollo come sito di maturazione, non di deposito

32 VIA LINFOIDE La produzione dei linfociti inizia nel midollo osseo con la differenziazione verso la linea linfoide delle cellule staminali emopoietiche multipotenti, dalle quali derivano tutte le cellule del sangue. Si formano dapprima i progenitori linfoidi precoci, dei quali un’aliquota permane nel midollo osseo dove compie il processo maturativo che porta alla formazione dei linfociti B, mentre un’altra aliquota abbandona precocemente il midollo per raggiungere, per via ematica il timo dove ha inizio e si conclude la maturazione dei linfociti T.

33 VIA MIELOIDE Eritropoiesi Mielopoiesi Trombopoiesi eritrociti
leucociti Mielopoiesi piastrine Trombopoiesi

34 ERITROPOIESI Eritropoietina Fattore delle cellule staminali (SGF)
Gli eritrociti maturano in sei giorni, permangono in circolo come reticolociti per due giorni e circolano nel sangue per centoventi giorni. Durante la maturazione, il globulo rosso diventa sempre più piccolo in volume e il nucleo da grosso scompare per frammentazione (all’osservazione sembra che all’interno della cellula ci sia un “reticolo”), venendo poi espulso. Durante la maturazione agiscono: Fattore delle cellule staminali (SGF) IL3 e IL9 Eritropoietina

35 ERITROPOIETINA

36 ERITROPOIESI EPO CFU-E Dalla citologia midollare: Proeritroblasto 
Eritroblasto basofilo aumenta la sintesi di emoglobina (Hb) colorazione rosata del citoplasma Eritroblasto policromatofilo nucleo picnoticomasserelle Eritroblasto ortocromatico (ammassamento materiale nucleare, emoglobinizzazione del citoplasma) espulsione nucleo Reticolocita, dimensioni > della cellula matura, con residui citoplasmatici di RNA ribosomiale (policromasia=diffusa colorazione grigiastra o bluastra), frammenti di ribosomi e altri organelli. Completa eliminazione dei residui avviene parte nel midollo osseo e parte nella circolazione. I globuli rossi normali trascorrono in circolo 1-2gg in forma di reticolociti e 120gg in forma di eritrociti maturi. EPO

37 CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
I reticolociti possono essere misurati manualmente o automaticamente. Nel metodo manuale lo striscio di sangue viene colorato con un colorante sopravitale (blu di metilene) che mette in risalto il RE che persiste all’interno dei reticolociti. I metodi automatici sono più accurati perché possono contare più cellule. Un campione di sangue viene trattato con un particolare colorante e passato attraverso uno strumento che conta le cellule e le caratterizza utilizzando un laser. La diffusione della luce viene usata per contare i reticolociti.

38 VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’ERITROPOIESI
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI (valutazione eritropoiesi) Il conteggio dei reticolociti è un importante indicatore dell’attività eritropoietica del midollo. Conteggio reticolociti osservato (CO): % dei globuli rossi circolanti. Nei neonati 2-6%. In condizioni di funzionalità midollare normale e adeguate riserve di ferro reticolocitosi è proporzionale alla perdita di sangue o distruzione dei globuli rossi. Valutazione di emorragie: Un episodio emorragico singolo causa reticolocitosi che inizia entro 24-48h e raggiunge un picco a 4-7gg, quando l’Hb si stabilizza si ritorna a livelli normali. Reticolocitosi persistente indica una perdita di sangue continua o ricorrente. Il conteggio dei reticolociti è importante nella: Diagnosi differenziale delle anemie Es. reticolocitosi come test per valutare carenza vitamina B12: se somministrazione di dosi fisiologiche di B12 non induce reticolocitosi non c’e carenza di B12 Es. anemia perniciosa e talassemia, eritropoiesi inefficace: popolazione eritroide iperplastica, ma conteggio reticolociti basso perché le cellule non maturano mai a sufficienza per entrare in circolo. Valutazione della risposta alla terapia Marziale (anemia da carenza di ferro): reticolocitosi indica che il midollo sta rispondendo con un’aumentata produzione di eritrociti.

39 MIELOPOIESI GM-CSF M-CSF G-CSF

40 GRANULOPOIESI I globuli bianchi impiegano 14 giorni per la maturazione (durante la quale passano attraverso le fasi di mielobla sto, promielocita, mielocita, metamielocita, granulocita) Vivono per 6-8 giorni, poi raggiungono il tessuto connettivale per due giorni. I globuli bianchi nello striscio midollare sono più grandi dei globuli rossi, il citosol è roseo e il nucleo è polilobato (più la cellula invecchia più il nucleo si frammenta). La formazione di granulociti neutrofili, eosinofili e basofili è influenzata da: G-CSF IL1, IL5, IL6

41 MIELOPOIESI G-CSF GRANULOCITI: neutrofili eosinofili e basofili.
Il > impegno della mielopoiesi è diretto vs la produzione della serie neutrofila, che, tra i leucociti circolanti, rappresenta numericamente la prima popolazione cellulare. Granulopoiesi : Pool proliferante o mitotico: mieloblasti promielociti mielociti Pool maturativo : metamielociti cellule a banda Pool di deposito (10gg): neutrofili Pool circolante (50%)  Pool marginato (strettamente aderente alla parete dei piccoli vasi). Normalmente non più del 5% dei granulociti circolanti è immaturo e la grande maggioranza di queste cellule si trova nel penultimo stadio di maturazione (cellule a banda). G-CSF

42 MIELOPOIESI M-CSF MONOCITI nei tessuti
Nel midollo i precursori dei monociti sono generalmente poco numerosi. Stimolati da M-CSF: Monoblasto promonocita  monocita maturo. I monociti rimangono in circolo ore prima di migrare nei tessuti e diventare macrofago. nei tessuti

43 TROMBOPOIESI I megacariociti sono i precursori delle piastrine circolanti e rappresentano la cellula del midollo di maggiori dimensioni. - Trombopoietina controlla la loro proliferazione e maturazione. - Durante la maturazione il nucleo va incontro a successive divisioni non seguite dalla divisione cellulare  cellula plurinucleata. Successivamente la formazione di membrane di demarcazione all’interno del citoplasma separa le singole piastrine che vengono rilasciate in circolo: 1 megacariocita  molte migliaia di piastrine. - Il numero di piastrine circolanti è mantenuto entro ristretti limiti di variazione e sembra controllato dalla massa totale di piastrine nell’organismo e dal rilascio di trombopoietina.

44 TROMBOPOIESI Trombopoietina

45 TROMBOPOIESI - Ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa piastrine - Le piastrine vivono mediamente giorni - Ogni giorno vengono prodotte piastrine/mmc - Se necessario, la loro produzione può aumentare anche di 8 volte - Dopo giorni vengono fagocitate dal sistema reticolo/endoteliale di milza e fegato

46 EMIVITA DELLE CELLULE DEL SANGUE
ERITROCITI 120 giorni PIASTRINE 4-5 giorni GRANULOCITI 6-8 ore MONOCITI 8 ore LINFOCITI VARIABILE

47 VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’EMOPOIESI
ASPIRATO MIDOLLARE Permette di apprezzare i dettagli, i rapporti reciproci e gli aspetti maturativi delle cellule midollari. Prelievo per aspirazione di piccolo quantitativo di materiale midollare della cavità midollare dalla cresta iliaca o dalla sterno e allestimento di uno striscio (Colorazione di Wright-Giemsa). Se non si riesce ad ottenere materiale dall’aspirazione: -attività emopoietica depressa (aplasia midollare); -il midollo contiene cellule molto immature, stipate, viscose (leucemia acuta); -fibrosi o metastasi midollari. BIOPSIA MIDOLLARE Prelievo di piccolo campione (cilindro) di tessuto midollare in genere dalla cresta iliaca. Permette di ottenere importanti informazioni sulla struttura del tessuto osseo e delle cellule tra di loro e con gli altri elementi del tessuto connettivale.

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49 ASPIRATO MIDOLLARE L’aspirato midollare nell’adulto è ormai quasi sempre eseguito a livello della cresta iliaca posteriore L’aspirato sternale, un tempo diffuso, è stato quasi del tutto soppiantato dall’aspirato dalle spine iliache posteriori superiori

50 Dove effettuare l’aspirato midollare
Sterno Cresta iliaca Tibia

51 ASPIRATO MIDOLLARE vetrino

52 Dall’aspirato midollare si ottengono le seguenti informazioni:
-quantità totale di cellule; -sequenza maturativa delle cellule della via eritro- e mielo-poietica. -conta differenziale. Variazioni della distribuzione dei vari tipi cellulari del midollo con l’età; -rapporto mielo-eritrocitario (ME); -presenza di anormalità citologiche: presenza di tipi cellulari rari (mast cells, osteoblasti, osteoclasti…), di cellule anormali (cellule neoplastiche metastatiche) o anormalità di maturazione. -elementi meno abbondanti del midollo (es. megacariociti, linfociti e plasmacellule); -depositi di ferro (test di Pearls).

53 BIOPSIA MIDOLLARE La biopsia osteomidollare è un tipo di indagine invasiva che permette di ottenere un frustolo di midollo emopoietico circondato da lamelle ossee. Il campione bioptico viene processato mediante fissazione/decalcificazione, inclusione e sottoposto a sezione. Le sezioni ottenute sono altamente rappresentative della struttura midollare

54 BIOPSIA MIDOLLARE

55 Dalla biopsia midollare si ottengono le seguenti informazioni:
- valutazione della cellularità e della sua distribuzione nel contesto del midollo - valutazione dell’architettura dell’osso - puntio sicca al mieloaspirato - ricerca di metastasi occulte L’aspirato midollare da informazioni migliori della biopsia nella diagnostica delle leucemie acute, delle mielodisplasie e di diversi tipi di anemie, questo perché fornisce dettagli morfologici sulle singole cellule, più precisi rispetto alle sezioni bioptiche. Aspirato midollare Biopsia midollare

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57 VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’EMOPOIESI
CELLULARITA’ MIDOLLARE = rapporto tra cellule emopoietiche in via di dfr e tessuto adiposo midollare. Parametro relativamente costante 1:1 – 2:1 tra cellule e grasso. Se > 1:1 – 2:1 indice di ipercellularità. Natura della linea cellulare più rappresentata fornisce importanti indicazioni sulla malattia in atto. La cellularità midollare varia a seconda dell’età del soggetto e della sede del prelievo. RAPPORTO MIELO-ERITROCITARIO (ME, valori normali 2:1-4:1) Il sangue circolante contiene circa 1000x di più globuli rossi che bianchi, mentre nel midollo le cellule nucleate della serie bianca sono più numerose di quelle nucleate della serie rossa con un rapporto di 3:1 (valori normali 2:1-4:1). Il rapido ricambio di granulociti, la persistenza del nucleo in queste cellule ed il fatto che cellule mieloidi mature vengano trattenute nel midollo spiegano perché all’esame del midollo la maggior parte delle cellule nucleate appartengano alla serie mieloide.

58 ASPIRATO MIDOLLARE Granulocita Leucemia acuta Aspirato normale

59 BIOPSIA MIDOLLARE Midollo osseo normale

60 BIOPSIA MIDOLLARE Midollo osseo iperplastico Midollo osseo aplastico

61 Midollo osseo nell’anemia aplastica