LA RESPIRAZIONE Il processo respiratorio consiste essenzialmente in una serie di reazioni ossidative finalizzate a demolire le molecole organiche (zuccheri,

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1 LA RESPIRAZIONE Il processo respiratorio consiste essenzialmente in una serie di reazioni ossidative finalizzate a demolire le molecole organiche (zuccheri, ma anche acidi grassi) per recuperare parte dell’energia chimica in essa contenuta sotto forma di energia libera (ATP) Dal punto di vista biochimico il processo può considerarsi suddiviso in tre fasi: la GLICOLISI il CICLO DEGLI ACIDI TRICARBOSSILICI TCA (detto anche ciclo di Krebs o ciclo dell’acido citrico) la FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA ASSOCIATA ALLA CATENA DI TRASPORTO ELETTRONICO

2 LA GLICOLISI AVVIENE NEL CITOSOL
LA GLICOLISI CONSISTE IN UNA VIA METABOLICA CARATTERIZZATA DA 10 PASSAGGI CHE CONVERTONO UNA MOLECOLA DI GLUCOSIO IN DUE MOLECOLE DI PIRUVATO CON LA CONTEMPORANEA PRODUZIONE DI DUE MOLECOLE DI ATP LA GLICOLISI AVVIENE NEL CITOSOL

3 LE 10 REAZIONI POSSONO ESSERE DISTINTE IN DUE DIVERSE FASI:
FASE DI INVESTIMENTO ENERGETICO: gli zuccheri fosfati vengono sintetizzati a spese dell’ATP ed il substrato a sei atomi di carbonio viene scisso in 2 zuccheri a tre atomi di carbonio FASE DI PRODUZIONE ENERGETICA: i triosi fosfati sono convertiti in composti ad alta energia che trasferiscono il fosfato all’ADP sintetizzando ATP

4 LA RESA NETTA DEL PROCESSO GLICOLITICO PER MOLE DI GLUCOSIO METABOLIZZATO E’ PARI A 2 MOLI DI ATP E 2 MOLI DI PIRUVATO VENGONO GENERATI ANCHE EQUIVALENTI RIDUTTIVI SOTTO FORMA DI NADH (2 MOLI) NEGLI ORGANISMI AEROBI, LA GLICOLISI E’ IL PRIMO PASSAGGIO DELLA COMBUSTIONE COMPLETA DEL GLUCOSIO A CO2 ED ACQUA

5 Fase di investimento energetico
GLUCOSIO 2 ADP 2 ATP Fase di produzione energetica 4 ADP 4 ATP 2 NAD NADH 2 piruvato Bilancio netto Glucosio  2 Piruvato 2 ADP  2 ATP 2 NAD  2 NADH

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7 FASE DI INVESTIMENTO ENERGETICO

8 LA FASE DI INVESTIMENTO E’ CARATTERIZZATA DA 5 REAZIONI
FOSFORILAZIONE ATP-DIPENDENTE DEL GLUCOSIO CATALIZZATA DALL’ENZIMA ESOCHINASI (G°’ = -16,7 kJ/mol). La fosforilazione del glucosio porta a due obiettivi: La reazione dell’esochinasi converte il glucosio nella forma fosforilata nella quale non può essere trasportato fuori dalla cellula La forma “attivata” è più labile del glucosio e ne permette la sua metabolizzazione L’esochinasi è un enzima che ha bassa specificità per gli zuccheri ed una bassa Km ed è inibita retroattivamente dal suo prodotto il glucosio-6-P E’ necessario lo ione Mg2+ poiché la forma reattiva dell’ATP è il suo complesso chelato con Mg2+.

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10 2) ISOMERIZZAZIONE DEL GLUCOSIO-6-P IN FRUTTOSIO-6-P DA PARTE DELL’ENZIMA FOSFOGLUCOMUTASI (G°’ = +1,7 kJ/mol) L’enzima è anche noto come FOSFOESOSOISOMERASI, la reazione (isomerizzazione di un aldoso in un chetoso) è reversibile alle normali concentrazioni cellulari dei due esosi fosfati

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12 La reazione è praticamente irreversibile in vivo
3) FOSFORILAZIONE ATP-DIPENDENTE DEL FRUTTOSIO-6-P IN FRUTTOSIO-1,6-bisP DA PARTE DELL’ENZIMA FOSFOFRUTTOCHINASI (PFK) (G°’ = -14,2 kJ/mol) La reazione è praticamente irreversibile in vivo Questo enzima rappresenta anche il sito primario della regolazione della glicolisi; la PFK è un enzima allosterico la cui attività è sensibile allo stato energetico della cellula, così come ai livelli di citrato ed acidi grassi. Il suo effettore allosterico è, come vedremo, uno degli ultimi intermedi della intera via (FOSFOENOLPIRUVATO).

13 4) SCISSIONE DEL FRUTTOSIO-1,6-bis-P IN 2 INTERMEDI A 3 ATOMI DI CARBONIO CATALIZZATA DALL’ENZIMA ALDOLASI (G°’ = + 23,9 kJ/mol) I due intermedi sono la GLICERALDEIDE-3-FOSFATO (GAP) ed il DIIDROSSIACETONFOSFATO (DHAP). Questa reazione sottolinea un importante principio metabolico. La reazione infatti è fortemente endoergonica (G0’ = +23,9 kJ/mol). In realtà nella cellula le concentrazioni di reagenti e prodotti sono tali che la reazione procede verso destra. Si mette quindi in evidenza la necessità di considerare le condizioni nella cellula e non le condizioni standard per decidere quale sia il senso della reazione. L’aldolasi attiva il substrato rendendone possibile la scissione mediante condensazione del carbonio chetonico con il gruppo amminico del sito attivo e formazione di una base di Schiff intermedia (condensazione di un gruppo amminico con un gruppo carbonilico).

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15 5) ISOMERIZZAZIONE DEL DIIDROSSIACETONFOSFATO IN GLICERALDEIDE-3-P DA PARTE DELLA TRIOSO FOSFATO ISOMERASI (G°’ = +7,6 kJ/mol) I due prodotti dell’aldolasi sono in equilibrio tra loro in una reazione catalizzata dalla TRIOSO FOSFATO ISOMERASI. Anche questa reazione è endoergonica (G0’ = +7,6 kJ/mol) in condizioni standard; la concentrazione intercellualre di GAP è piuttosto bassa e questo sposta l’equilibrio verso destra

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17 FASE DI RESA ENERGETICA

18 LA FASE DI RESA E’ CARATTERIZZATA DA 5 REAZIONI
OSSIDAZIONE NAD-DIPENDENTE E FOSFORILAZIONE DELLA GLICERALDEIDE-3-P IN 1,3-bis-P GLICERATO CATALIZZATA DALL’ENZIMA GLICERALDEIDE-3-FOSFATO DEIDROGENASI (G°’ = kJ/mol) La seconda fase della glicolisi inizia con una reazione in cui si ha la riduzione del NAD ossidato a NADH e la contemporanea ossidazione del carbonio carbonilico con scambio di due elettroni e produzione di un gruppo carbossilico. La reazione è normalmente esoergonica, ma diviene endoergonica perché l’enzima utilizza l’energia rilasciata per sintetizzare un composto ad altissima energia, l’acido 1,3-bis-FOSFOGLICERATO

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20 2) FOSFORILAZIONE AL LIVELLO DEL SUBSTRATO CON SINTESI DI ATP E FORMAZIONE DELL’1-3-bisP GLICERATO IN 3-FOSFOGLICERATO OPERATA DALLA FOSFOGLICERATO CHINASI (G°’ = -18,8 kJ/mol) Il composto precedentemente formato viene utilizzato da questo enzima per la produzione di ATP e 3-FOSFOGLICERATO (FOSFORILAZIONE AL LIVELLO DEL SUBSTRATO) L’1,3-bis-fosfoglicerato per il suo elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosfato possiede una grande tendenza a cedere il suo gruppo fosfato all’ADP con formazione di ATP Essendo state investite 2 moli di ATP e con le due moli che si formano in questa reazione, il bilancio netto in produzione di ATP è uguale a 0

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22 3) ISOMERIZZAZIONE DEL 3-FOSFOGLICERATO IN 2-FOSFOGLICERATO DA PARTE DELL’ENZIMA FOSFOGLICERATO MUTASI (G°’ = +4,4 kJ/mol) Il 3-fosfoglicerato viene quindi isomerizzato a 2-fosfoglicerato. Nella reazione è richiesto anche lo ione Mg2+ La reazione è di nuovo endoergonica in condizioni standard, ma la concentrazione intracellulare di 3-PGA è elevata rispetto a quella del 2-PGA, per cui la reazione procede verso destra

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24 4. DISIDRATAZIONE DEL 2-FOSFOGLICERATO IN FOSFOENOLPIRUVATO CATALIZZATA DALL’ENZIMA ENOLASI (G°’ = kJ/mol) Da questa reazione si libera il PEP, un altro composto ad alta energia; la reazione prevede una disidratazione che ha l’effetto di aumentare enormemente l’energia libera di idrolisi del fosfato. Da –15.6 kJ/mol del 2-PGA a – 61.9 kJ/mol del PEP

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26 5. FOSFORILAZIONE AL LIVELLO DEL SUBSTRATO CON SINTESI DI ATP E FORMAZIONE DEL PIRUVATO DA PARTE DELLA PIRUVATO CHINASI (G°’ = - 31,4 kJ/mol) Nell’ultima reazione della glicolisi il PEP trasferisce il suo fosfato all’ADP nel corso di una FOSFORILAZIONE AL LIVELLO DEL SUBSTRATO. La perdita del fosfato da parte del PEP porta alla produzione della forma enolica del PIRUVATO, un composto molto instabile che spontaneamente tautomerizza nella forma chetonica. L’enzima richiede ioni Mg2+ e K+ . Questa reazione è un altro punto di regolazione della glicolisi che determina la produzione netta di 2 moli di ATP.

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28 REGOLAZIONE DELLA GLICOLISI
La glicolisi è strettamente legata ad altre importanti vie metaboliche per la produzione e utilizzazione dell’energia; vedi utilizzazione dell’amido, alla gluconeogenesi, alla via dei pentosi fosfati ed al ciclo dell’acido citrico Le reazioni catalizzate dalla ESOCHINASI, FOSFOFRUTTOCHINASI e dalla PIRUVATO CHINASI procedono con una riduzione dell’energia libera E SONO TUTTE E TRE REGOLATE ALLOSTERICAMENTE

29 1) La conoscenza dei meccanismi di controllo della glicolisi è ancora imperfetta
La maggiore funzione regolatoria viene svolta dalle reazioni catalizzate dalla FOSFOFRUTTOCHINASI e dalla PIRUVATO CHINASI Delle 10 reazioni coinvolte nella glicolisi, quelle catalizzate dalla fosfofrutto-chinasi, dalla esochinasi e dalla piruvato chinasi sono caratterizzate da un rapporto prodotto/substrato molto più basso della loro costante di equilibrio Questo significa che le reazioni catalizzate da questi enzimi sono lontano dall’equilibrio e quindi irreversibili in condizioni normali. Tutte le altre reazioni della glicolisi sono invece molto vicine all’equilibrio e quindi reversibili

30 Regolazione allosterica della FOSFOFRUTTOCHINASI
Tra gli attivatori della PFK si annoverano : AMP ADP FRUTTOSIO-2,6-BISFOSFATO Tra gli inibitori si annoverano : ATP CITRATO PEP

31 Regolazione allosterica della PIRUVATO CHINASI
Tra gli inibitori si annovera anche per questo enzima l’ATP Un secondo effetto allosterico è rappresentato dall’attivazione a feedforward da parte del FRUTTOSIO-1,6-bis-FOSFATO ACETIL-CoA

32 DESTINO METABOLICO DEL PIRUVATO
Il destino del piruvato è in funzione dello stato di ossidazione della cellula Nella reazione catalizzata dalla G3PDH una mole di NAD+ viene ridotta a NADH. Per mantenere lo stato redox della cellula questo NADH deve essere ri-ossidato a NAD+ Quando la glicolisi avviene in condizioni aerobiche questa funzione viene espletata dalla catena di trasporto elettronico mitocondriale che, tra l’altro, genera ATP Quindi in condizioni di aerobiosi, l’ATP viene generato direttamente dal processo glicolitico (2 moli) e successivamente dalla ri-ossidazione del NADH

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34 Ulteriori molecole di NADH vengono generate nel ciclo successivo della respirazione (ciclo dell’acido citrico o ciclo TCA). Il piruvato, infatti, entra nel ciclo TCA nella forma di acetil-CoA che è il prodotto della decarbossilazione ossidativa operata dall’enzima PIRUVATO DEIDROGENASI Diverso è il destino del piruvato in condizioni di anaerobiosi, quando la catena di trasporto elettronico mitocondriale non può funzionare così come il ciclo TCA. L’ossidazione del NADH, necessaria perché la glicolisi possa continuare a funzionare, viene operata da due processi alternativi: la FERMENTAZIONE LATTICA e la FERMENTAZIONE ALCOLICA

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37 Il NADH è sempre ossidato a NAD+
La fermentazione è un processo che produce energia attraverso molecole organiche che fungono da donatore ed accettore di elettroni I microrganismi sono capaci di effettuare diversi tipi di fermentazione La maggior parte dei composti naturali, ma anche i prodotti dell’uomo, vengono degradati dai microrganismi. In ambiente anaerobico questa degradazione coinvolge il processo della fermentazione Tutti i processi fermentativi si reggono su un principio univoco: Il NADH è sempre ossidato a NAD+

38 PERCHE’ ESISTE IL PROCESSO DELLA FERMENTAZIONE?
In assenza di ossigeno il ciclo TCA e la catena di trasporto mitocondriale si bloccano proprio per il fatto che non c’è l’accettore finale di elettroni Quindi se il piruvato non può essere ulteriormente ossidato nel ciclo TCA e la catena di trasporto elettronico mitocondriale non funziona e quindi l’ATP non può essere sintetizzato, la glicolisi rappresenta l’unica fonte di ATP per la cellula. Ma l’aumento della concentrazione di piruvato determina una inibizione della glicolisi e, se il NADH non viene ri-ossidato, si ha anche una riduzione della concentrazione di NAD+ necessario per la glicolisi LA FERMENTAZIONE CONVERTE IL PIRUVATO IN COMPOSTI ORGANICI DIVERSI E QUINDI RIDUCE LA SUA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE E RIGENERA NAD+ DA NADH

39 Esistono diversi tipi di fermentazione:
Fermentazione alcolica: è la fermentazione più importante a carico dei glucidi, utilizzata da tempo immemorabile per la produzione di vino, birra e pane. Il piruvato viene convertito in alcol etilico e CO2 Fermentazione omolattica: trasforma il glucosio in acido lattico, ad opera dei batteri Lactobacillus e Streptococcus. Viene utilizzata per produrre yogurt, per la maturazione dei formaggi, nella conservazione di alcuni vegetali (cetrioli, crauti, olive in salamoia) Fermentazione eterolattica: questa trasformazione produce, oltre ad acido lattico, anche alcool etilico e anidride carbonica. Viene utilizzata per la produzione di Kefir, un latte fermentato acido-alcolico che si può produrre anche partendo da acqua Fermentazioni ossidative: Queste trasformazioni non sono vere e proprie fermentazioni, poiché avvengono in presenza di ossigeno

40 FERMENTAZIONE ALCOLICA
IN QUESTO PROCESSO IL GLUCOSIO ED IL FRUTTOSIO VENGONO CONVERTITI IN ALCOOL ETILICO CON LA PRODUZIONE DI ANIDRIDE CARBONICA MENTRE L’UVA CONTIENE COME TALI I DUE ESOSI, NEL CASO DI ORZO E GRANO (per produrre birra e pane) L'AMIDO DEVE ESSERE PRIMA IDROLIZZATO A GLUCOSIO VIENE  ATTUATA DA LIEVITI DETTI ANCHE SACCAROMICETI, ORGANISMI UNICELLULARI EUCARIOTI SI VERIFICA NEGLI ALIMENTI CONTENENTI CARBOIDRATI CON pH SPICCATAMENTE ACIDO LA REAZIONE DI FERMENTAZIONE ALCOLICA IN AMBIENTE ANAEROBICO CONSENTE DI RI-OSSIDARE IL NADH

41 QUOTIDIANAMENTE ABBIAMO A CHE FARE CON LA FERMENTAZIONE ALCOLICA, AD ESEMPIO NEL VINO
TROVIAMO PRESENTI SULLA BUCCIA DEGLI ACINI D'UVA DEI LIEVITI CHE EFFETTUANO IL PROCESSO DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA QUESTO PROCESSO DEL VINO DURA GENERALMENTE DAI 6 AGLI 8 GIORNI ALTRO ESEMPIO COMUNE E'  LA BIRRA,  OTTENUTA AGGIUNGENDO AL MALTO D'ORZO O DI ALTRI CEREALI SACCAROMICETI E LUPPOLO PER QUANTO RIGUARDA IL PANE, I LIEVITI SI TROVANO SULLA SUPERFICIE DEI CHICCHI DI GRANO. UNA VOLTA OTTENUTA LA FARINA E MESCOLATA CON L'ACQUA SI OTTIENE UN IMPASTO CHE VIENE FATTO CUOCERE

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43 Nella prima reazione il piruvato viene decarbossilato dalla piruvato decarbossilasi, un enzima che necessita per la sua azione catalitica del coenzima tiamina pirofosfato (TPP). La seconda reazione è reversibile e coinvolge la riduzione dell’acetaldeide ad etanolo attraverso l’azione dell’enzima alcool deidrogenasi. Il potere riducente per questa reazione viene fornito dal NADH prodotto durante il processo glicolitico. Il NAD+ generato durante il processo viene riutilizzato per la glicolisi.

44 FERMENTAZIONE OMOLATTICA
L’acido lattico è l’unica molecola che si forma in questo processo grazie alla riduzione del piruvato operata dalla Lattato Deidrogenasi in condizioni di anaerobiosi. Questo meccanismo alternativo comporta la riossidazione del NADH attraverso la contemporanea riduzione del PIRUVATO E’ tipicamente condotta da specie del genere Lactobacillus e da molti streptococchi Questi batteri vengono utilizzati per la produzone di yogurt, burro, formaggi etc.

45 Tipicamente avviene fermentazione omolattica in:
- CELLULE MUSCOLARI degli animali durante un intenso esercizio fisico accumulano un debito di ossigeno che induce la trasformazione dell'acido piruvico in acido lattico che da'  la sensazione di dolore e di fatica muscolare. Il riposo ripristina una situazione di aerobiosi : l'acido lattico è ritrasformato in acido piruvico e il dolore sparisce - YOGURT è un latte fermentato. Il latte pastorizzato viene fatto fermentare con i microrganismi specifici (Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus termophilus), raffreddato e conservato a 4°C fino al momento del consumo, dove si presenta come prodotto vivo e vitale - FORMAGGIO, è il prodotto della maturazione della cagliata, ottenuta dalla coagulazione del latte intero o scremato o della crema di latte, sufficientemente liberata dal siero

46 FERMENTAZIONE ETEROLATTICA
Questa trasformazione produce, oltre ad acido lattico, anche alcool etilico e anidride carbonica Viene utilizzata per la produzione di Kefir, un latte fermentato acido-alcolico che si può produrre anche partendo da acqua Questa via è caratterizzata dalla presenza dell’enzima fosfochetolasi, che trasforma i pentosi in GAP ed acetil-fosfato E’ compiuta soprattutto da batteri eterolattici (Lactobacillus e Leuconostoc) che vengono utilizzati nell’industria fermentativa. Il kefir è un prodotto fermentato del latte, analogo dello yogurt, ma è il prodotto della fermentazione eterolattica

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48 FERMENTAZIONI OSSIDATIVE
Queste trasformazioni non sono vere e proprie fermentazioni, poiché avvengono in presenza di ossigeno Quando l'ossidazione del glucosio è completa, si ottiene anidride carbonica e ossigeno, se è incompleta si ottengono sostanze diverse È questo il caso della fermentazione acetica che ottiene acido acetico da alcool etilico (utilizzata per produrre aceto), e di quella citrica che ottiene acido citrico da glucosio. Quest'ultima e altre fermentazioni sono utilizzate industrialmente per produrre acido citrico e altre sostanze di varia natura