La regolazione di OLR1 ad opera del miR-24 è genotipo-dipendente.

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1 La regolazione di OLR1 ad opera del miR-24 è genotipo-dipendente.
LO SNP rs ALTERA IL SITO DI LEGAME DEL miR-24 E REGOLA L’ESPRESSIONE DEL GENE OLR1, PRINCIPALMENTE IMPLICATO NEI PROCESSI CELLULARI DI ATEROSCLEROSI E TUMORIGENESI Morini E.1, Rizzacasa B.1, Pucci S.1, Polidoro C.1, Ferrè F.3, Caporossi D.2, Helmer Citterich M.3, Novelli G.1, Amati F. 1 1-Dip. di Biomedicina e Prevenzione, Università di Tor Vergata, Roma; 2-Dip. di Scienze Motorie, Umane e della Salute, Università Foro Italico, Roma; 3-Dip. di Biologia, Università di Tor Vergata, Roma INTRODUZIONE LOX-1 (Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1), codificato dal gene OLR1, è il principale recettore endoteliale per le ox-LDL e svolge un ruolo chiave nei processi patogenetici che portano allo sviluppo di aterosclerosi (Pirillo et al., 2013). Recenti evidenze correlano l’iperespressione di LOX-1 e la tumorigenesi. Nonostante i recenti progressi nella prevenzione di queste patologie, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche rimane cruciale. L’epigenetica ed in particolare l’azione dei microRNA (miRNA) risultano essere alla base della maggior parte dei nuovi approcci investigativi. Attraverso analisi di predizione in silico è stato possibile identificare, nella sequenza del 3’UTR del gene OLR1, un putativo sito di legame di un microRNA, hsa-miR-24. Questo sito è “naturalmente” mutato dalla presenza dello SNP rs (G/A). OBIETTIVO L’obiettivo principale di questo lavoro è quello di analizzare la rilevanza a livello funzionale del miR-24 sull’espressione fisiologica del gene OLR1 ai fini di una valutazione sull’opportunità di uno screening dello SNP rs per la stratificazione del rischio di aterosclerosi e cancro. MATERIALI E METODI ANALISI IN SILICO: Analisi in silico sulla coding sequence e sulla 3’UTR del gene OLR1 usando i software TargetScan v6.0 e miRanda. SAGGIO DI LUCIFERASI: La 3’UTR del gene OLR1 contenente il sito putativo di binding del miR-24 (G) o il sito “naturalmente” mutato (A) è stata subclonata nel vettore psiCHECK-2, a valle della Renilla Luciferase, a partire dai cloni genomici GM06991 e GM07053B. Il vettore pEFDEST51 pre-miR-24-2 (Qian et al., 2011) è stato utilizzato per over-esprimere il miR-24. 2X106 cellule sono state seminate e trasfettate con 5 µg di DNA totale usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dopo 24h dalla tasfezione, il saggio di Luciferasi è stato condotto usando il kit Dual Glo® Luciferase Assay (Promega). GENOTIPIZZAZIONE LINEE CELLULARI: Il DNA genomico è stato estratto seguendo il protocollo del kit Flexigene (Qiagen). Per analizzare lo SNP rs in cellule HeLa e HepG2 è stato utilizzato un saggio TaqMan Genotyping (C_ _30; Life Technologies). TRASFEZIONE LINEE CELLULARI: Cellule HeLa e HepG2 (ATCC) sono state seminate (25,000 cell/cm2) e trasfettate con 5 µg di pEFDEST51 premiR-24-2 usando Calcium Phosphate Transfection Kit (Invitrogen). Dopo 48 e 72h dalla trasfezione le cellule sono state recuperate e risospese in 1 ml Trizol (Ambion) per procedere all’ estrazione dell’RNA. ANALISI DI ESPRESSIONE OLR1 E ISOFORME: L'RNA totale retrotrascritto è stato analizzato tramite qRT-PCR (SYBR Green, Applied Biosystems) utilizzando i seguenti primers: OLR1_F: 5'-GCACAGCTGATCTGGACTTCAT-3', R: 5'-CCCCATCCAGAATGGAAAACT-3', LOXIN_F: 5'-AAAAGAGCCAAGAGAAGTGCTTGT-3', R: 5'-TCTAAATCAGATCAGCTGTGC-3' e OLR1D4_F: 5'-TTGTTCAGGACTTCATCCAGC-3', R: 5'-TCGGACTCTAAATAAGTGGGG-3’. Geni house-keeping: RPL37A e β-actina. WESTERN BLOT: Le proteine sono state separate tramite SDS-PAGE e trasferite su una membrana PVDF (Amersham-Pharmacia Biotech) incubata 1h a RT con latte scremato al 3% (Difco Lab) e Tween 20 allo 0,5% (USB). Anticorpi primari: anti-LOX-1 rabbit policlonal (Abcam) e anti-b-actin mouse IgG monoclonal (Sigma-Aldrich). Anticorpi secondari: coniugati con perossidasi di rafano. I segnali sono stati rilevati con il metodo Super Signal-detection (Thermo Scientific) e quantificati tramite densitometria. Gene house-keeping: β-actina. IMMUNOCITOCHIMICA: L'espressione di LOX-1 è stata valutata usando un anticorpo primario anti-LOX-1 (R&D) e un secondario biotinilato Goat anti-rabbit IgG. SAGGIO DI PROLIFERAZIONE LINEE CELLULARI: Le cellule trasfettate (6X103 cell/cm2) sono state contate dopo 24, 48, 72 e 96h. La colorazione con Trypan blu è stata effettuata per valutare la mortalità. Il conteggio delle cellule è stato eseguito tramite emocitometro. RISULTATI L'analisi in silico ha permesso l’identificazione di 89 putativi siti di legame per microRNA sulla sequenza nucleotidica di OLR1. Ventitre di questi siti presentano SNPs nella regione di legame. Lo SNP rs (G> A) mappa nella 3'UTR del gene OLR1 e si trova all'interno della regione di legame del miR-24 (Fig. 1). Il saggio di Luciferasi, svolto per testare l'interazione tra la 3'UTR di OLR1 e il miR-24, ha evidenziato una significativa (p<0,0005) riduzione del livello di luciferasi nelle cellule HeLa trasfettate con il plasmide OLR1 3'UTR (G); al contrario, il livello non cambia quando le stesse cellule vengono trasfettate con un plasmide 3'UTR OLR1 (A) (Fig. 2). Figura 1 Figura 2 Questi risultati confermano che OLR1 è un nuovo target del miR-24 e che l’interazione in vitro tra miR-24 e OLR1 è fortemente dipendente dallo SNP rs Abbiamo quindi analizzato l’espressione di OLR1 e delle sue isoforme di splicing (mRNA e proteine) in due linee cellulari umane con diverso genotipo rs (A/G e A/A). Come atteso, le cellule HeLa (A/G) over-esprimenti miR-24 mostravano una significativa diminuzione dell'espressione di OLR1 rispetto alle cellule trasfettate con il vettore di controllo; al contrario le cellule HepG2 (A/A) non evidenziavano cambiamenti significativi (Fig. 3A-B). Figura 3 L’immunocitochimica (ICC) mostrava una significativa down-regolazione di LOX-1 ad opera del miR-24 nella linea cellulare HeLa (A/G) (Fig. 4C–F). Al contrario, l'espressione di OLR1 non cambiava in cellule HepG2 (A/A) over-esprimenti miR-24 (Fig. 4G-L). Figura 4 Inoltre l’over-espressione del miR-24 inibiva la crescita cellulare in cellule HeLa ma non in cellule HepG2 nelle stesse condizioni (p<0,01, Fig. 5). Figura 5 CONCLUSIONI La regolazione di OLR1 ad opera del miR-24 è genotipo-dipendente. Lo SNP rs localizzato nella 3'UTR di OLR1, potrebbe contribuire a modulare il rischio di sviluppare aterosclerosi. OLR1 potrebbe essere un nuovo target terapeutico per il miR-24 e rappresentare un punto di partenza per lo sviluppo di possibili strategie contro le malattie legate all'over-espressione di OLR1. Grant Fondazione Roma: “Non Communicable Diseases (NCDs): Development of a integrated protocol based on environmental and genetic/epigenetic data for the risk prediction of AMI in patients with coronary atherosclerosis”.