La corsa al sequenziamento dei genomi batterici

Presentazione sul tema: "La corsa al sequenziamento dei genomi batterici"— Transcript della presentazione:

1 La corsa al sequenziamento dei genomi batterici

2 Genomi al di sotto della cellula minima!!
Despite their size, each retains some genes that enable provisioning of limiting nutrients or other capabilities required by hosts. Genome sequence analyses show that genome reduction is an ongoing process, resulting in a continuum of sizes, with the smallest genome currently known at 112 kilobases. Genome reduction is typical in host-restricted symbionts and pathogens, but the tiniest genomes are restricted to symbionts required by hosts and restricted to specialized host cells, resulting from long coevolution with hosts. Genes are lost in all functional categories, but core genes for central informational processes, including genes encoding ribosomal proteins, are mostly retained, whereas genes underlying production of cell envelope components are especially depleted. Thus, these entities retain cell-like properties but are heavily dependent on coadaptation of hosts, which continuously evolve to support the symbionts upon which they depend.

3 Genomi di piccole dimensioni e adattamento all’ambiente:
parassitismo obbligato Il caso di Buchnera, un batterio affine a E. coli, parassita obbligato degli afidi. Ne gli afidi ne il batterio possono vivere senza uno dell’altro : non si possono trattare gli afidi con antibiotici che uccidono il batterio ne si possono coltivare in provetta i batteri!! Batterio Afide Aminoacidi essenziali che l’insetto non trova nella pianta di cui si nutre , Batterio Afide Nutrienti ed energia per il metabolismo Gli afidi si nutrono della linfa delle piante un liquido povero di proteine e richiedono 10 AA che non sanno sintetizzare . I batteri sintetizzano gli aAA ma utilizzano i metaboliti dell’ospite pe rdar el’avvio alla sintesi

4 Buchnera vive all’interno di cellule degli afidi dette batteriociti.
La riduzione del genoma di Buchnera è considerevole 450Kb -670 Kb In Buchnera molti geni coinvolti nella sintesi di aminoacidi sono portati da plasmidi multicopie che ne aumentano il dosaggio genico L’adattamento di Buchnera alla vita intracellulare ha portato ad una riduzione del suo genoma con perdita dei geni per la sintesi degli aminoacidi forniti dall’ospite e conservazione di quelli per la biosinteside glia aminoacidi essenziali.

5 Riduzione dei genomi

6 Ma dove vivono i batteri con i genomi super minimi??
Diagram showing location of obligate symbionts within bacteriocytes in an insect. Individual symbiont cells are typically surrounded by a host-derived membrane within the bacteriocyte cytosol. Bacteriocytes are often clustered into a bacteriome, usually located in the insect abdomen

7 P-endosymbionts of insects are characterized by their occurrence in specialized host cells called bacteriocytes, which are located at various positions in the insect body depending on the host group1. Bacteriocytes are sometimes grouped into organ-like structures called bacteriomes that occur in the body cavity of aphids and in the anterior gut region of tsetse flies.

8 Posizionamento dei geni sul cromosoma e trascrizione
Il posizionamento dei geni sul cromosoma è in parte condizionato da come si muove l’apparato di replicazione. Possima definire due regioni definiti replichores che dividono il genoma in due metà corrispondenti al movimento delle due forche. In ognuno di questi replichores ci sarà un ‘elica leading ed una lagging strand che saranno opposte. E’stato osservato che: - Il numero geni trascritti nella stessa direzione in cui si muove la forca replicativa è maggiore rispetto ai geni trascritti in direzione opposta ovvero filamento leading e filamento codificante corrispondono. - Il cromosoma nelle due opposte metà può presentare asimmetria nel contenuto in G+C, nell’orientamento dei geni nell’accumulo di mutazioni , nella biosintesi di aminoacidi essenziali.

9 L’assimetria delle due porzioni indica
1- che grossi apparati macromolecolari che replicano ( DNA polimerasi) e trascrivono( RNA polimerasi ) il DNA sono coordinati . Infatti i due apparati entrano in collisione quando vi sono eventi di trascriione in senso opposto alla replicazione. In E. coli i geni espressi ad alta frequenza come i 7 operoni per gli RNA ribosomiali e 53 degli 86 geni per i tRNA sono nella leading strand

10 Un altro aspetto dell’asimmetria riguarda la composizioni in basi delle eliche C/G e A/T dei singoli filamenti che si osservata in 185 genomi ( appartenenti a 11 Phyla) e non si trova in lievito , Drosophila e uomo. Perché si origina? Essendo replicati in modo asimmetrico e si potrebbero aacumulare mutazioni silenti sui frammenti codificanti Distribuzione dei geni, orientamento e posizione sono fattori non casuali

11 SEQUENZE GENOMICHE ED EVOLUZIONE ; quale contributo?
La disponibilità di intere sequenze genomiche da molti microrganismi costituisce un’opportunità unica per ottenere una descrizione più obiettiva delle relazioni evolutive tra i diversi microrganismi La scoperta che i processi di trasferimento genico orizzontale (HGT) perdita di geni svolgono un ruolo cruciale nell’evoluzione dei microrganismi ha profondamente influito sugli studi dei genomi batterici. In particolare è cambiato il concetto che mutazioni all’interno dei singolo geni fossero la fonte principale delle variazioni fenotipiche in funzione della selezione naturale.

12 Meccanismi di plasticità genomica
Trasferimento genico orizzontale (HGT) Riduzione dei genomi ( Genome reduction) Duplicazioni geniche e riarrangiamenti genomici Generazione di mutazioni puntiformi si intende il processo con il quale l’informazione genetica viene trasferita tra batteri diversi

13 Plasticità genomica un esempio importante: E. coli
Un pool di geni comuni di 4.1 Mb e poi possiamo trovare sequenze specifiche dei E. coli patogeni in questo caso 1.3Mb in più) o nel ceppo di laboratorio (0.5 Mb)

14 Meccanismi che contribuiscono alla plasticità del genoma
Elemento genetico o meccanismo Acquisizione di proprietà _______________________________________________ Mutazioni puntiformi Ricombinazione omologa Trasformazione IS,elementi compositi Integroni Trasposoni coniugativi e plasmidi Batteriofagi GEI , PAI, isolotti Conseguenze Alterazione dell’espressione genica Riarrangiamenti DNA, inversioni , duplicazioni, delezioni, integrazione di DNA per HGT Acquisizione di informazione genetica Inserzioni, delezioni, inversioni, alterazione espressione genica Trasferimento di geni, riarrangiamenti del DNA Coniugazione, HGT, Mobilizzazione Trasduzione generalizzata e specializzata HGT HGT, Integrazione delezione di grandi regioni di DNA

15 Disponibilità di un ampia gamma di genomi di batteri ha fornito delle informazioni notevoli sull’evoluzione dei genoma dei microrganismi Due fenomeni contrastanti non spiegabili con un meccanismo di evoluzione VERTICALE: Drammatiche differenze nel genoma di microrganismi simili quali E.coli ed Haemophilus o tra E.coil 0157 ed E.coil K12. Ampie regioni di omologie tra genomi di batteri filogeneticamente distanti o tra ARCHEA e di BATTERI HGT è uno dei principali meccanismi per spiegare l’evoluzione dei microrganismi

16 Horizontal gene tranfer HGT
Trasferimento genico orizzontale o trasferimento genico laterale è un fenomeno evolutivo che coinvolge scambi genetici tra differenti linee evolutive Per lungo tempo si è dibattuto sul ruolo del HGT nell’evoluzione perché variava completamente la tradizionale visione dell’evoluzione della vita ed era difficile da provare Nel 1991 si riusci a dimostrare che in E.coli 10-16% del genoma risultava da HGT: Il fenomeno quindi aveva un ruolo essenziale nell’evoluzione

17 Ma che percentuale rappresenta il DNA acquisito per HGT?
La lunghezza delle barre rappresenta la quantità di DNA codificante suddiviso in DNA “nativo (in blu), DNA presente in elementi genetici mobili (in giallo) e DNA proveniente da HGT o straniero (in rosa). I numeri si riferiscono alle percentuali di DNA “straniero”

18 HGT e la filogenesi HGT (Horizontal GeneTransfer) è un evento molto frequente e coinvolge ceppi appartenenti a gruppi tassonomici distanti. ha profondamente modificato la filogenesi di tutti i procarioti . Nella visione darwiniana la filogenesi è il risultato di modificazioni e diversificazioni che avvengono nella discendenza verticale attraverso le generazioni HGT implica la trasmissioni di caratteri non alla discendenza ma ORIZZONTALMENTE. Geni diversi possono quindi aver subito strade evolutive diverse all’interno dello stesso organismo.

19 Effetti del HGT sulla filogenesi
Dalle sequenze dei genomi emerge che i segmenti trasferiti orizzontalemnte sono molto numerosi e coinvolgono ampie regioni . L’albero filogenetico considerando HGT asume quindi un aspetto ramificato

20 Horizontal Gene Transfer (HGT)
Definito anche Trasferimento Genico Laterale (HGT and LGT) Come avviene : le principali strategie sono : Trasformazione : frammenti di DNA nudo penetrano o sono captati dalle cellule Trasduzione I batteriofagi fanno transitare DNA batterico da una cellula donatrice ad una ricevente : c’è un limite nella quantità di DNA trasferito determinata dalle dimensioni della testa fagica Coniugazione : necessita di elementi genetici mobilli quali I plasmidi , gli ICE, richiede il contatto cellula-cellula possono passare frammenti di DNA di dimensioni maggiori

21 Le 3 strategie a confronto nella trasmissione di geni di antibiotico resistenza

22 EVOLUZIONE DEL GENOMA BATTERICO
Genoma di base Genoma flessibile Cromosoma Plasmidi Integroni Trasposoni Fagi Isole genomiche Patogenicità Metabolismo secondario Degradazione Resistenza ad antibiotici Simbiosi Struttura cellulare Replicazione Vie metaboliche costitutive HTG

23 Classici esempi di HGT Geni di antibiotico resistenza su plasmidi Le sequenze di Inserzione o IS Le Isole di Patogenicità I geni per le tossine sui plasmidi Il plasmid eTi di Agrobacterium

24 Instabilità nel nuovo ospite
Che cosa serve perchè avvenga il trasferimento Disponibilità del DNA donatore Stabilità del DNA nell’ambiente Un vettore per la trasmissione (fago/plasmide/ICE) Un sistema di captazione e inserimento Un sistema di mantenimento Un sistema pe rla stabilizzazione Un vantaggio selettivo Quali sono limiti e che cosa può prevenire il trasferimento Instabilità nel nuovo ospite I sistemi di restrizione L’incompatibilità nell’uso di codoni Mancanza di geni appropiati per l’espressione Silenziamento dei geni trasferiti

25 Tre principali caratteristiche nell’evoluzione di un patogeno sono trasmesse da HGT:
ANTIBIOTICO RESISTENZA DETERMINANTI DI PATOGENICITA’ DETERMINANTI COINVOLTI NELL’ADATTAMENTO METABOLICO o MIGLIORAMENTO DELLA FITNESS

26 I plasmidi permettono lo scambio genetico tra le diverse specie e sono tra i principali responsabili del Trasferimento Genico Orizzontale (HGT)

27 ANTIBIOTICO-RESISTENZA
I determinanti di antibiotico resistenza sono spesso associati con elementi genetici mobili quali: plasmidi integroni superintegroni trasposoni complessi isole genomiche di antibiotico resistenza INTEGRONI sono dei sistemi naturali : per il clonaggio ed espressione genica in grado di incorporare ORF e convertirle in geni funzionali Costituiscono sistema primario per ‘evoluzione della antibiotico resistenza e cattura dei geni di virulenza ( specialmente nei batteri Gram- SUPERINTEGRONI sono dei sistemi di stoccaggio delle cassette geniche con funzioni diverse

28 Come si può rilevarela presenza di sequenze arrivate per HGT
Le sequenze arrivate in un nuovo genoma per HGT mantengono per un periodo più o meno lungo le caratteristiche del genoma d’origine distinte dal genoma ricevente Analisi della sequenza di DNA Alberi filogenetici Contenuto in G+C Utilizzazione dei codoni

29 Confrontando le omologie di un gene con l’albero filogenetico ottenuto con quello relativo rRNA 16S

30 Confrontando il contenuto in G+C
Nel DNA G (Guanina) sono accoppiate con le C ( Citosina) Misurando la quantità in G+C di una determinata regione Se una regione ha un contenuto in G+C molto diverso dalla gran parte del genoma molto probabilmente deriva da HGT 52% % %

31 L’utilizzazione dei codoni è tipica di ogni specie

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33 Le principali strutture coinvolte nel trasferimento genico orizzontale
PAIs Fagi Plasmide Tn

34 Struttura di F e di un classico plasmide R1 contenente numerosi geni di antibiotico resistenza

35 Plasmide di virulenza di Shigella contiene numerose IS
rosso geni di virulenza blu IS

36 I plasmidi sono i responsabili del processo di coniugazione: potente sistema di trasferimento genico intra ed inter specie

37 Gli elementi trasponibili dai più semplici ai più complessi
Caratteristiche comuni 1.Contengono i geni per la trasposasi 2.Contengono delle sequenze inversamente ripetute all’estremità 3.Generano duplicazioni dirette nel sito d’inserzione

38 Struttura di Tn10 IS10L TC IS10R Pout 38bp
IS difettivo IS funzionale IS10L TC IS10R Pout 38bp la transposasi agisce in cis metilazione previene il legame della trasposasi al DNA metilazione previene la sintesi della trasposasi Pin Tnp

39 Struttura di Tn5 IS50L Km IS50R Tnp* Tnp Tnp* Tnp* Tnp* IS funzionale
IS difettivo IS funzionale IS50L Km IS50R Tnp* Tnp Tnp* Tnp* Tnp*

40 si noti il taglio solo al 3’( replicativa) e
Trasposizione conservativa e replicativa a confronto: si noti il taglio solo al 3’( replicativa) e al 3’ e 5’(conservativa ) nella molecola donatore

41 Struttura dei trasposoni di tipo Tn3 ( TnAp)
Modalità di trasposizione di tipo replicativo RES TnpA TnpR ApR RES I II III TnpR resolvasi e repressore della trasposasi

42 INTEGRONI sono elementi genetici che hanno la capacità di recuperare geni e di farli esprimere
Gli integroni sono caratterizzati da 3 elementi chiave: un gene (intI)che codifica per l’integrasi, un enzima in grado di indurre ricombinazione sito specifica; una sequenza specifica (attI) che viene utilizzata per l’integrazione integrasi-mediata; un promotore orientato verso l’esterno che permette l’espressione del gene integrato.

43 Struttura degli integroni
Integrasi Promotore Sequenza d’integrazione Cassetta genica

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45 Gli INTEGRONI integrano al loro interno non geni casuali ma specifiche cassette geniche caratterizzate: - geni fiancheggiati da sequenze specifiche di DNA riconosciute dall’integrasi; - geni che non si esprimono finchè non vengono integrati nell’integrone e possono essere trascritti dal promotore dell’integrone

46 Le cassette geniche condividono delle caratteristiche strutturali comuni generalmente contengono un singolo gene hanno delle sequenze invertite ripetute all’estremità 3’ definito sito attC o sequenza 59 bp Gli integroni non sono elementi mobili di per se come le sequenze IS o i Tn ma sono associati ad elementi trasponibili o a plasmidi coniugativi che li possono veicolare all’interno della stessa specie o tra specie diverse.

47 Da una a molte antibiotico-resistenze: evoluzione di un trasposone

48 Gli ICE : Integrative conjugative elements
fagi , plasmidi o trasposoni? Gli ICE si ritrovano integrati nel cromosoma dell’ospite in un sito specifico ( attB) e sono fiancheggiati da sequenze specifiche definite attL and attR. In seguito ad excisione precisa tramite ricombinazione sito specifica tra le sequenze attL e attR si ottiene la molecola di ICE circolare che conterà il sito attP mentre sul cromosoma della cellula l ospite si troverà il sito att B. Durante il processo di coniugazione con una cellula ICE-free, il donatore ed il recipiente vengono in contatto e una singola elica di ICE viene trasferita tramite il meccanismo a cerchio rotante. Dopo il trasferimento la DNA polimerasi del recipiente riformerà una molecola circolare a doppia elica. Tramite ricombinazione sito specifica tra i siti attP dell’ICE e attB del cromosoma l’ICE si integrerà nel cromosoma del recipiente.

49 Gli ICE sono normalmente integrati nel cromosoma della cellula ospite e sono replicati e trasmessi alle cellule figlie allo stato integrato come fossero regioni del cromosoma del batterico. In alcune condizioni gli ICE si possono excidere dal cromosoma batterico, formando un intermedio circolare. L’intermedio circolare si replica ed un filamento viene trasferito alle cellula recipiente tramite un poro di coniugazione. I componenti del sistema di trasferimento sono codificati dall’ICE.

50 PATOGENICITA’ FITNESS
I geni di virulenza sono frequentemente localizzati su elementi genetici mobili o ex mobili quali le isole di patogenicità PAI I geni acquisiti devono poi inserirsi in sistemi di regolazione che permettano di ottimizzare l’espressione e di coordinarla con gli altri geni di virulenza Spesso i sistemi a due componenti o le proteine del nucleoide annettono sotto il loro controllo i nuovi geni in modo che vengano espressi in risposta a stimoli ambientali ed in modo coordinato FITNESS Determinanti coinvolti nel miglioramento dell’adattamento all’ambiente o nel potenziamento delle strategie di sopravvivenza possono essere trasferrti per HGT e si ritrovano sia in batteri patogeni che in commensali

51 Prova diretta sperimentale ( raramente possibile) Prova indiretta
Come si può arrivare all’identificazione che una data sequenza provenga da HGT? Prova diretta sperimentale ( raramente possibile) Prova indiretta Analisi filogenetica : generare alberi filogenetici per ogni gene analisi particolare per i geni sono molto distanti rispetto al restante genoma Miglior appaiamento (Best Sequence Match Detection) : ricerca in data base della omologia di sequenza con altri genomi ed osservazione della distribuzionedi questo regione Analisi della composizione nucleotidica (Nucleotide Compositional Analysis) batteri esibiscono una grande variabilità nel contenuto in GC ma i geni all’interno di un genoma sono molto simili in termini di composizione di basi, uso dei codoni. I frammenti di DNA ottenuti tramite HGT mantengono le caratteristiche di sequenza del genoma del donatore

52 ISOLE DI PATOGENICITA’
Contengono uno o più geni di virulenza Sono presenti solo nei ceppi patogeni Sono di grandi dimensioni kb Hanno un diverso contenuto in G+C (recente HTG) Sono spesso inserite in geni per tRNA Sono fiancheggiate da sequenze di DNA direttamente ripetute (DR) Sono associate a elementi genetici mobili Sono instabili Rappresentano strutture a mosaico

53 Adattamento Percorso evolutivo nell’origine di una PAI Fago Plasmide
Trasposone coniugativo . fago plasmide Delezione a Fago Plasmide cromosoma Percorso evolutivo nell’origine di una PAI Formazione di un cointegrato Trasferimento orizzontale Ricombinazione Integrazione Mutazione, HOMING Adattamento

54 Stadi evolutivi della formazione dell’isola di patogenicità
Formazione di una PAI come parte del core genomico Integrazione di fagi e plasmidi Mutazioni puntiformi nei geni d’integrasi Inattivazione/delezione dei geni mobili Grandi delezione dei geni inattivati tempo Codoni di di adattamento

55 Le Isole di Patogenicità si possono excidere dal genoma attraverso ricombinazione tra le sequenze presenti nelle sequenze direttamente ripetute (DR)

56 Non soltanto Pathogenicity Island : il fenomeno coinvolge altri gruppi di geni Genomic Island
Geni di virulenza Pathogenicity island Uropathogenic E.coli Geni per la simbiosi Symbiosis Island Mesorhizobium loti Geni per l’utilizzazione di zuccheri Metabolic Island Salmonella senftenberg Geni per la resistenza ad uno o più antibiotici Resistance Island Staphylococcus aureus

57 Caratteristiche generali delle Isole genomiche
Sono regioni di DNA acquisite tramite HGT inserite nelle vicinanze dei tRNA. Sono fiancheggiate da DR Contengono diversi geni coinvolti nel processo di adattamento Contengono elementi IS funzionali o difettivi contiene geni legati alla motilità Ruolo fondamentale svolto dal gene INT che codifica per l’INTEGRASI coinvolta nell’inserzione e delezione di regioni di DNA fiancheggiate da DR

58 Come si identifica un ‘isola genomica?
Analisi comparativa del genoma per ibridazione sottrattiva : identificazione delle regioni tipiche di un genoma tRNA scrrening: analisi delle regioni fiancheggianti i tRNA Rilevazione delle informazione genetiche acquisite per HGT:strutture ripetute, IS e trasposoni, analisi della composizione in base , uso dei codoni etc Island probing: analisi della stabilità di una regione usnd controselezioni idonee

59 Evoluzione di un microrganismo

60 Pseudogeni e dimensioni dei genomi
Ochmann and Davalos, 2006

61 La selezione sembra operare più efficacemente sulle specie che vivono anche nell’ambiente e non solo nell’ospite. Dal momento che la selezione permette di eliminare i geni deleteri queste specie contengono ampi genomi con un numero relativamente piccolo di psudogeni o elementi genetici mobili. In patogeni recenti abbiamo invece un accumulo di pseudogeni a dimostrazione della grande plasticità di questo genomi In specie che sono da lungo tempo dipendenti dall’ospite invece la tendenza verso l’insorgenza di delezioni ha eliminato tutte le sequenze superflue determinando genomi molto ridotti con pochi pseudogeni o Tn

62 Y.psudotubercolosis Y.pestis Acquisizione di 2 plasmidi necessari per la sopravvivenza nell’uomo e per la trasmissione tramite mosche Bacillus cereus B.antracis Acquisizione del plasmide codificante la tossina P.luminescens like P.asymbiontica acquisizione di un plasmide

63 Riduzione del genoma Perdita di funzioni geniche Vantaggio selettivo
L’acquisizione di geni è controbilanciata dalla perdità di geni nativi: l’insorgenza di delezioni costituisce una delle principali forze per il modellamento del genoma Perdita di funzioni geniche Vantaggio selettivo Molti pseudogeni non espressi in Y.pestis sono funzionali in altre specie di Yersinia la perdita dei geni contribuisce all’adattamento di Y.pestis al vettore ( insetto) che è un prerequisito per la trasmissione del patogeno all’uomo tramite le mosche PATOGENI INTRACELLULARI OBBLIGATI Clamydia Ricktetsia Buchnera aphidicola Blochmania Perdita di notevoli quantità di materiale genetico, programmata in modo da assicurare la persistenza a lungo termine nell’ospite

64 Modellamento del genoma : le strategie

65 Genoma di E.coli : esempio di grande variabilità
La sequenza dell’intero genoma di E.coli ha rivelato una variabilità intraspecie estremamnte elevata Sono disponibiliti 4 sequenze genomiche di E.coli Analisi genomica comparativa ha rivelato che E.coli ha un genoma di 1 Mb più grande di quella di E.coli K12 e circa 25% dei geni non sono conservati nel genoma di E.coli K12. Molti dei geni presenti in 0157 si pensa siano stati acquisiti tramite eventi di trasferimento orizzontale e tramite elementi genetici mobili quali fagi, profagi e sequenze IS Soltanto geni sono in comune tra i 4 genomi di E.coli mentre erano tra E.coli K12 e 0157 I 3000 geni comuni presentano SINTENIA suggerendo una base di trasmissione verticale

66 L’intuizione di Carl Woese di utilizzare il gene che codifica per RNA16S per la costruzione degli alberi filogenetici è ancora valida e resta un ‘analisi necessaria per stabilire la filogenesi tra gruppi tassonomici . La struttura dell’RNA ribosomiale è tale che alcune regioni implicate nella formazione delle strutture tridimensionali complesse sono estremamente conservate e le loro sequenze si sono evolute lentamente differenziandosi molto poco tra gruppi filogeneticamente distanti