Spettrometria di Massa applicata a studi su Proteine e Peptidi Laboratorio di Chimica Analitica SICSI VII Ciclo Docente: Prof. S. Andini.

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1 Spettrometria di Massa applicata a studi su Proteine e Peptidi Laboratorio di Chimica Analitica SICSI VII Ciclo Docente: Prof. S. Andini

2 PREREQUISITI OBIETTIVI
Destinatari: questa lezione è destinata a studenti del IV anno di un Istituto Tecnico Industriale ad indirizzo chimico. PREREQUISITI Buona conoscenza della chimica Conoscenza dei principi di base della spettrometria di massa Conoscenza degli amminoacidi, del legame peptidico, di peptidi e proteine, e delle loro proprietà strutturali OBIETTIVI Comprendere le principali caratteristiche di uno spettrometro di massa, con particolare riferimento all’analisi di biomacromolecole come peptidi e proteine Comprendere i fondamenti delle tecniche di ionizzazione di biomacromolecole

3 SPETTROMETRO DI MASSA Sistema per Alto Vuoto Inlet Sorgente
Analizzatore Campione Detector ES FAB MALDI EI CI Diretto GC LC CE Quadrupolo TOF Magnetico Trappola Ionica Spettro di massa SPETTROMETRO DI MASSA

4 IONIZZAZIONE ELETTROSPAY
La sostanza è introdotta in soluzione in un ago capillare e ne fuoriesce sotto forma di aerosol (goccioline di diametro di 1-2mm). Tra l’ago e il mantello della camera (elettrodo cilindrico) è creata una differenza di potenziale di alcuni KV che induce sulle goccioline un eccesso di carica positiva. A causa delle loro ridotte dimensioni, il solvente evapora rapidamente da ogni gocciolina che diventa sempre più piccola; la densità di carica aumenta finché diventa così alta da determinare l’espulsione di ioni di soluto dalla gocciolina. Gli ioni così prodotti sono poi spinti attraverso un sistema di fenditure fino ad entrare nella zona a bassa pressione dove sono accelerate verso l’analizzatore.

5 EQUILIBRIO IN SOLUZIONE DI STATI A MULTIPLA CARICA
DI PEPTIDI/PROTEINE A BASSI VALORI DI pH M E H F R W G K 4+ AA N-terminale H 4+ 3+ 2+ 1+

6 ORIGINE DEGLI SPETTRI ES DI PEPTIDI
m/z = (Mr+4H)/4 m/z = (Mr+3H)/3 m/z = (Mr+2H)/2 m/z = (Mr+H) H 4+ 3+ 2+ 1+ 1+ 2+ 3+ 4+ Inten. Rel. m/z ES-MS

7 Spettro ESI-MS di GroEL da Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125
Spettro deconvoluto

8 VANTAGGI E SVANTAGGI DELLA ESI
Analisi di molecole molto grandi come le proteine Elevata sensibilità senza interferenza dovuta alle matrici Assenza di frammentazione in sorgente Accoppiamento con HPLC (separazione di miscele complesse) Sistemi MS/MS, con possibilità di frammentazione Formazione di ioni multicarica misti con riduzione della sensibilità

9 MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION
Variable Ground Grid Grid +20 kV Piastra MALDI Laser 1. Il campione (M) è miscelato con un eccesso di matrice (A) e lasciato asciugare su piastra MALDI 2. Il fascio Laser ionizza le molecole di matrice 3. Le molecole di campione sono ionizzate mediante trasferimento in fase gassosa di protone dalla matrice: AH+ + M  A + MH+ MH+

10 acido a-ciano-4-idrossicinnamico
acido sinapinico acido a-ciano-4-idrossicinnamico acido sinapinico (acido 3,5-dimetossi-4-idrossi cinnamico) acido 2,5-diidrossibenzoico (2,5-DHB) acido a-ciano-4-idrossicinnamico Peptidi ( pmol/l) Proteine ( pmol/ l) Oligonucleotidi ( pmol/ l) acido 3-idrossipicolinico (3-HPA) 2,4,6-triidrossi- acetofenone (THAP)

11 VANTAGGI E SVANTAGGI DELLA IONIZZ. MALDI
Senza limite di massa registrabile Tecnica molto versatile: si può ionizzare qualsiasi composto Buona sensibilità: tutti gli ioni arrivano al detector Strumenti facili da usare Bassa risoluzione: impraticabili esperimenti ad alta risoluzione (problema oggi risolto con l’adozione della tecnica “delayed extraction” abbinata all’uso del “TOF Reflector”)

12 Spettro MALDI di una miscela peptidica

13 ANALIZZATORE QUADRUPOLARE (Q)
L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale.

14 TRAPPOLA IONICA (IT) La trappola ionica è un analizzatore a quadrupolo con barre iperboliche piegato su se stesso in modo da formare un'anello. L'elettrodo centrale (il "buco della ciambella") è eliminato, ed il voltaggio continuo ed alternato sono applicati tra l'elettrodo esterno e gli elettrodi inferiore e superiore, che diventano due superfici convesse. Due piccoli buchi sugli elettrodi inferiore e superiore permettono la introduzione e l'uscita degli ioni. E’ possibile intrappolare per un tempo lungo a piacere gli ioni e farli frammentare grazie alla presenza di un gas.

15 TOF: ANALIZZATORE A TEMPO DI VOLO
Flight Tube Detector Ion Source 15-25 kV All’interno del tubo di volo gli ioni più leggeri viaggeranno verso il detector più velocemente di quelli più pesanti. Principio: se gli ioni sono accelerati con lo stesso potenziale a partire da un punto fissato e ad un fissato tempo iniziale e sono lasciati liberi di muoversi sotto la spinta iniziale, essi si separeranno sulla base del diverso rapporto massa/carica.

16 SPETTROMETRO DI MASSA TANDEM seleziona lo ione da frammentare
Sistema per alto vuoto seleziona lo ione da frammentare Inlet Sorgente Analizzatore 1 Campione Diretto LC CE ES FAB MALDI Quadrupolo TOF Magnetico Cella di collisione Frammentazione Analizzatore 2 Spettro di frammentazione Detector

17 Schema di frammentazione di un peptide
+NH3-CH-CO-NH-CH-COOH C-term R3 R4 serie y NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH R1 R2 R3 R4 NH2-CH-CO-NH-CH-CO+ R1 R2 N-term serie b

18 Spettro di frammentazione a bassa energia teorico di un peptide
+ + + + F L G K F L G K + + b3 y1 F L G K + + + + F L G K F L G K CID b2 y2 + F L G K + + + + F L G K F L G K b1 y3 y1 y3 b1 y2 b2 Relative Intensity K G L F b3 F L G K m/z

19 -Leu-Leu -Gly -Asn -Val -Leu -Phe -Gly-Lys -Phe -His -Ala -Leu
105 120 Leu-Leu-Gly-Asn-Val-Leu-Phe-Cys-Val-Leu-Ala-His-His-Phe-Gly-Lys 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Abundance 1328.3 -Leu-Leu -Gly -Asn -Val -Leu -Phe -Gly-Lys -Phe -His -Ala -Leu 1215.6 1474.7 1427.5 1068.2 1129.5 1337.7 1197.2 1623.5 1017.3 1601.2 1547.7

20 ANALISI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA DI POLIPEPTIDI
La spettrometria di massa applicata alle proteine consente: misure dirette di massa molecolare su molecole proteiche intatte esperimenti di mappatura molecolare detezione di sostituzioni amminoacidiche identificazione di proteine studi strutturali a bassa risoluzione su proteine o complessi proteici identificazione di modifiche post-traduzionali

21 alchilazione, idrolisi enzimatica
IDENTIFICAZIONE DI PROTEINE ATTRAVERSO PROCEDURE DI SPETTROMETRIA DI MASSA 66 45 30 Identificazione delle proteine 1000 1500 2000 Mass (m/z) Estrazione peptidi, analisi di massa Escissione bande, lavaggio, riduzione, alchilazione, idrolisi enzimatica Ricerca in Database