Cristallizzazione di macromolecole biologiche

Presentazione sul tema: "Cristallizzazione di macromolecole biologiche"— Transcript della presentazione:

1 Cristallizzazione di macromolecole biologiche

2 Tecniche che danno informazioni circa la struttura di una macromolecola
Cristallografia a raggi x NMR Microscopio elettronico Diffrazione di neutroni Diffrazione di elettroni

3 Cristallografia a raggi x

4 Crystallization X-ray Diffraction data collection 1. Grow crystals
2. Measure diffraction X-ray Diffraction data collection

5 Struttura dei cristalli
Cella elementare

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11 I cristalli di macromolecole sono costituiti in media dal 50% di solvente. Questo provoca:
Fragilità Particolari condizioni di cristallizzazione Diffrattogrammi scadenti Struttura nativa Possibilità di studiare complessi

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17 Cinetica del processo di cristallizzazione
[Protein] Solubility Supersaturation Metastabile Undersaturated Precipitation Crystals Growth & Nucleation Growth only Barrier of Nucleation Soluble protein

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20 Formazione di un cristallo
I Nucleazione II Crescita del nucleo III Cessazione della crescita IV Nella regione metastabile i nuclei stabili continuano a crescere

21 Una volta raggiunta la zona metastabile il nucleo cresce lentamente
Una volta raggiunta la zona metastabile il nucleo cresce lentamente. In queste condizioni si ottengono i cristalli

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23 Termodinamica del processo di cristallizzazione
ΔG = ΔH – TΔS I precipitati amorfi corrispondono a minimi locali, il cristallo corrisponde ad un minimo assoluto. Talvolta la barriera di energia è piccola e si possono ottenere cristalli

24 Fattori che influenzano la solubilità delle proteine
pH Temperatura Effetto di agenti precipitanti Sali Solventi organici Polimeri a lunga catena

25 La morfologia del cristallo spesso è direttamente correlata al pH.
In alcuni casi, il pI è il valore di pH al quale si ha la migliore crescita del cristallo.

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27 La temperatura è un altro fattore importante nella cristallizzazione di proteine.
μ = potenziale chimico della molecola in soluzione μc =potenziale chimico delle molecole nel cristallo La solubilità di una proteina in una soluzione salina tende ad aumentare a basse temperature, mentre in soluzione di PEG e MPD la solubilità diminuisce al diminuire della temperatura.

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29 Effetto dei sali Effetto salting-in: aumenti della solubilità in funzione della forza ionica A bassa concentrazione di sale la subilità della proteina cresce leggermente. Gli ioni del sale dissociano e si legano alla superficie della proteina liberando la proteina dal solvente e aumentando l’acqwua libera ln s/sw= z2e2Nk/ [2DRT(1+ak)] s= solubilità in soluzione salina sw= solubilità in acqua pura z= carica netta e= carica dell’elettrone N= numero di Avogadro D= costante dielettrica R= costante universale dei gas T= temperatura (K) a= somma dei raggi della proteinae della media degli ioni in soluzione k= 8N/1000 DKT  I con K= costante di Boltmann e I= forza ionica

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31 La solubilità diminuisce all’aumentare della forza ionica
Raggiunto una certa concentrazione di sali si ha l’effetto salting-out tutti i siti di binding sulla superficie della proteina diventano occupati e gli ioni interagiscono con il solvente La solubilità diminuisce all’aumentare della forza ionica log s = A - Ks I/2 A e Ks sono costanti empiriche, Ks è la costante di salting-out ed è caratteristica del sale

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33 I sali sono tra i più comuni agenti precipitanti usati nella cristallizzazione di macromolecole.
L’abilità di un sale di precipitare le proteine può essere generalmente descritta dalla serie di Hofmeister: Anioni e cationi che sono più deboli hanno effetto di salting-in piuttosto che salting-out

34 Sali non caotropici Sali caotropici
Interagiscono con l’acqua, provocano la formazione di interazioni tra le molecole di proteina Sali non caotropici Inducono denaturazione nelle molecole proteiche interagendo con gli elementi di struttura secondaria Sali caotropici

35 Come i sali i polimeri a lunga catena competono con le proteine in soluzione per il solvente.
Se misuriamo la costante dielettrica dell’acqua in presenza di PEG vediamo che si abbassa notevolmente questo comporta un aumento della distanza alla quale le molecole si attraggono. La solubilità delle macromolecole varia in funzione della concentrazione di PEG secondo la relazione: log S = β + K [PEG] S = solubilità K e β sono costanti empiriche

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37 Effetto dei solventi organici
La variazione della solubilità di una proteina in una soluzione contenente solventi organici è descritta dalla relazione: ln s/sw=A/RT (1/D0 - 1/D) A=costante D0=costante dielettrica dell’acqua D=costante dielettrica della soluzione contenente solventi organici

38 MPD 2-metil-2,4-pentandiolo
L’effetto dei solventi organici sul processo di cristallizzazione è molto simile a quello dei polimeri. Le molecole organiche competono con le molecole di proteina per il solvente, e abbassano la costante dielettrica della soluzione. Questi effetti comportano la formazione di interazione tra le macromolecole. Ad alte concentrazioni alcuni solventi organici possono destabilizzare le macromolecole MPD 2-metil-2,4-pentandiolo 2,5-esandiolo

39 Strategia della cristallizzazione
Agenti precipitanti Additivi Proprietà chimico-fisiche Sali Solventi organici Polimeri a lunga catena

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