Replicazione del DNA Il Dogma centrale della biologia

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1 Replicazione del DNA Il Dogma centrale della biologia
Il DNA può replicare Il DNA può essere trascritto in RNA L’mRNA può essere tradotto in sequenze proteiche Le proteine determinano il nostro fenotipo

2 Modelli di replicazione del DNA
La replicazione del DNA è la sintesi di un nuovo filamento di DNA a partire da un filamento stampo.

3 IL MECCANISMO DI REPLICAZIONE DEL DNA E’
Gli esperimenti di Meselson e Stahl indicano che i filamenti del DNA si separano durante la replicazione IL MECCANISMO DI REPLICAZIONE DEL DNA E’ SEMICONSERVATIV0 Gradiente di cesio : quando ad una soluzione di cesio viene applicata una forza centrifuga elevata la soluzione diventa più densa verso il fondo della provetta . Una molecola di DNA si muove verso la regione della provetta in cui la sua densità è uguale a quella della soluzione salina

4 La replicazione del DNA è semiconservativa
La replicazione è semiconservativa: ogni filamento di DNA funge da stampo per la sintesi del filamento complementare La replicazione del DNA è semiconservativa in eucarioti, procarioti, virus and batteriofagi.

5 La replicazione del DNA è semiconservativa
Movimento della forcella di replicazione Forcella di replicazione

6 La replicazione inizia in un sito di origine
MECCANISMO SEMICONSERVATIVO La replicazione inizia in un sito di origine Le catene di DNA parentale sono completamente disavvolte prima della replicazione ? La replicazione inizia in un punto qualunque o in un sito ben preciso? Cellule cresciute in terreno contenente H3 La replicazione è un processo altamente coordinato, in cui le catene parentali vengono disavvolte e replicate simultaneamente a partire da un punto ben preciso Formazione di un’ansa

7 La replicazione inizia in un sito di origine e procede in entrambe le direzioni
La replicazione procede in una o in entrambe le direzioni? Una o entrambe le estremità dell’ansa sono punti dimamici Forcelle di replicazione Dove il DNA viene disavvolto e rapidamente replicato e riavvolto

8 Polimerizzazione del DNA
La sintesi del DNA richiede deossiribonucleosidi trifosfati ed una struttura innesco: stampo

9 IL DNA E’ SINTETIZZATO ALLUNGANDO IL TERMINALE 3’ DELL’INNESCO
L’idrolisi del pirofosfato è il motore per la sintesi del DNA La sintesi del DNA procede in direzione 5’- 3’ con polarità opposta a quella dello stampo.

10 Azione della DNA polimerasi: le DNA polimerasi aggiungono deossiribonucleosidi trifosfato all’estremità 3’-OH della catena in crescita così che la nuova catena viene sintetizzata in direzione 5’  3’. (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi -

11 Successiva idrolisi del pirofosfato
PPi + H2O 2 Pi L’idrolisi del pirofosfato è catalizzata da un enzima distinto: pirofosfatasi Questa reazione fornisce una forte spinta termodinamica nella direzione della sintesi L’aggiunta di un nucleotide e l’idrolisi del pirofosfato comportano la rottura di due legami fosfato ad alta energia. La sintesi del DNA è un processo irreversibile (dNMP)n + dNTP (dNMP)n Pi

12 La sintesi del DNA procede in direzione 5’ 3’ ed è semidiscontinua

13 Le DNA polimerasi sono gli enzimi che
sintetizzano il DNA Sia le cellule Procariotiche che quelle Eucariotiche contengono molteplici DNA polimerasi Una sola DNA polimerasi può sintetizzare un nuovo filamento di DNA mentre le altre sono coinvolte in ruoli sussidiari e/o partecipano alle reazioni di riparazione RUOLO ESTENDE UNA CATENA DI DNA AGGIUNGENDO UN NUCLEOTIDE ALLA VOLTA ALL’ESTREMITA’ 3’ OH LIBERA

14 Le varie DNA polimerasi sono specializzate in ruoli differenti all’interno della cellula
Soltanto una DNA polimerasi è la REPLICASI, mentre le altre partecipano alla riparazione del DNA danneggiato

15 DNA POLIMERASI I In E. coli la DNA polimerasi I è il prodotto del gene polA. E’ un singolo polipeptide di PM dalton Svolge una serie di funzioni di pulizia durante i processi di replicazione, ricombinazione e riparazione Possiede un’ esclusiva attività esonucleasica (5’ ’) di fondamentale importanza durante i processi di riparazione del DNA e per la rimozione dei primer di RNA durante il processo replicativo Possiede tre attività diverse: attività polimerasica 5’ -> 3’ (sintesi DNA) B. attività esonucleasica 3’ -> 5’ (correzione bozze) C. attività esonucleasica 5’ -> 3’ (rimozione primer)

16 DNA POLIMERASI II In E. coli la subunità polimerasica della DNA polimerasi II è il prodotto del gene polB. E’ costituita da 7 diverse subunità La sola subunità polimerasica è di dalton La DNA Pol II sembra avere una funzione altamente specializzata nell’ambito del processo riparativo del DNA

17 DNA POLIMERASI III In E. coli la DNA polimerasi III è il principale complesso enzimatico coinvolto nella replicazione del DNA procariotico E’ costituita da 10 diverse subunità La subunità , prodotto del gene polC, possiede attività polimerasica. La subunità polimerasica  è di dalton

18 LE DNA POLIMERASI SONO ENZIMI PROCESSIVI
PROCESSIVITA’ Numero medio di nucleotidi polimerizzati dall’enzima nell’unità di tempo Ogni Polimerasi è caratterizzata da una propria processività La velocità di sintesi è dovuta alla natura processiva dell’enzima Il “rate limiting step” è il legame della polimerasi al complesso stampo-innesco. Il mantenimento di livelli intracellulari bilanciati dei 4 dNTP garantisce la processività della replicazione.

19 Proprietà delle DNA Polimerasi di E. coli
DNA Pol III: poco abbondante e altamente processiva

20 La sintesi del DNA è catalizzata dalla DNA polimerasi
Il sito attivo della DNA polimerasi non distingue tra i 4 nucleotidi ma riconosce l’identica geometria che caratterizza le coppie di basi A:T e G:C. Distanza non ottimale tra il 3’ OH dell’ innesco e il fosfato in alpha del nucleotide da aggiungere Soltanto le coppie di basi complementari posizionano il 3’OH sull’innesco e il fosfato alpha ad una distanza utile per l’attacco nucleofilo. Questo è un esempio di selettività cinetica.

21 La DNA polimerasi discrimina i ribonucleotidi
Nonostante la concentrazione dei NTP sia circa 10 volte maggiore di quella dei dNTP, la DNA polimerasi discrimina in modo estremamente efficiente i ribonucleotidi che possono essere incorporati con un’efficienza molto bassa (1/1000). La discriminazione è dovuta al fatto che c’è un impedimento sterico nei confronti degli a.a. (a.a. discriminatori ) dovuto alla presenza del 2’OH.

22 La DNA polimerasi somiglia ad una mano che afferra il complesso innesco : stampo
La struttura della DNA polimerasi assomiglia ad una mano destra parzialmente chiusa nella quale si colloca il complesso stampo innesco. Il palmo costituito da un foglietto beta contiene gli elementi del sito catalitico e controlla la correttezza dell’appaiamento delle basi Il palmo forma con le bp numerosi legami H attraverso il solco minore della doppia elica neosintetizzata

23 La struttura della DNA polimerasi
La funzione delle “dita” è quella di trattenere il dNTP nella corretta posizione per la reazione catalitica. Le dita provocano anche una curvatura dello stampo in modo da esporre al sito attivo solo la prima base dopo l’innesco. Dopo la formazione del legame fosfodiesterico le dita si riaprono e consentono lo spostamento del complesso innesco stampo di una coppia di basi. Il bending permette di esporre al sito attivo solo la prima base dello stampo che si trova dopo l’innesco. Tale base è nella posizione corretta affinchè possa formarsi la doppia elica

24 La struttura della DNA polimerasi
Il pollice non interviene nella catalisi ma interagisce con il DNA neosintetizzato La funzione del “pollice” è quella di stabilizzare il complesso tra DNA polimerasi e substrato in modo da aumentare il numero di nucleotidi che possono essere aggiunti ogni volta che la DNA polimerasi si lega al complesso innesco-stampo.

25 L’attività 3’- 5’ esonucleasica della DNA polimerasi corregge eventuali errori fatti sul DNA neosintetizzato L’incorporazione di basi errate (ca. 1 su 105) diminuisce l’affinità per il dominio catalitico. Gli appaiamenti errati vengono quindi immediatamente rimossi (processo “delete key” tasto di cancellazione dei nucleotidi appena inseriti) ad opera dell’attività 3’- 5’ esonucleasica presente nella DNA polimerasi (detta anche attività di “proofreading”). La rimozione della distorsione provocata dall’appaiamento errato ripristina l’affinità per il dominio catalitico (palmo) e consente alla replicazione di continuare. L’attività proofreading aumenta la fedeltà della replicazione di circa 100 volte. Un ulteriore livello di accuratezza è garantito dai meccanismi di riparazione del DNA.

26 La forca replicativa I due filamenti di DNA vengono replicati contemporaneamente. L’inizio della replicazione richiede la separazione dei due filamenti in modo da esporre i due filamenti stampo. La natura antiparallela del DNA complica il processo di replicazione per il fatto che per uno dei filamenti la sintesi del DNA procede nella direzione della replicazione (leading strand), mentre per l’altro procede in direzione opposta (lagging strand). La sintesi del filamento lagging è ritardata per consentire alla forca replicativa di formare un singolo filamento sufficientemente lungo. Si formano così i frammenti di Okazaki (lunghi nt nei batteri e nt negli eucarioti. Tali frammenti sono successivamente saldati.

27 Primasi e RNA primer Tutte le DNA polimerasi richiedono un innesco che fornisca il 3’OH. A questo scopo intervengono le primasi: RNA polimerasi che sintetizzazo corti (5-10 nt) RNA primer che fungono da innesco per la DNA polimerasi. L’attività delle primasi non è sequenza-specifica. Il completamento della replicazione richiede l’azione della RNasi H che idrolizza l’innesco a RNA, di una 5’esonucleasi che idrolizza l’ultimo ribonucleotide, della DNA polimerasi che chiude il gap generatosi E della DNA ligasi che salda il nick

28 Può legare sia il filamento lento che quello veloce
DNA elicasi e formazione della forca replicativa L’apertura della doppia elica e la progressione della forca replicativa richiede l’attività della DNA elicasi, un omoesamero che circonda un singolo filamento di DNA e si muove sfruttando l’energia fornita dall’idrolisi di ATP, nella stessa direzione della forca replicativa. DNA elicasi enzima processivo che rimanendo associato al substrato separa un numero molto elevato di bp Ciascuna elicasi si sposta lungo il DNA in una direzione precisa (polarità) che può essere sia 5’ 3’ che 3’ 5’ Può legare sia il filamento lento che quello veloce

29 single stranded binding protein
Per impedire il riappaiamento dei filamenti separati dalla elicasi il DNA a singolo filamento viene ricoperto da SSB (single stranded binding protein) mediante la formazione di legami cooperativi sequenza-indipendenti.

30 uno e entrambi i filamenti di DNA.
Problemi topologici della replicazione del DNA La progressione della forca replicativa presenta dei problemi topologici dovuti alla formazione di superavvolgimenti positivi che devono essere rimossi per non rallentare e infine bloccare il processo di replicazione. Tale attività è svolta dalle DNA topoisomerasi che tagliano e risaldano uno e entrambi i filamenti di DNA.

31 Le proteine Sliding Clamp
La processività della DNA polimerasi viene drasticamente aumentata dal legame con la proteina Sliding Clamp (pinza scorrevole). In assenza di tale proteina la DNA polimerasi non sarebbe in grado di sintetizzare più di nt per volta. La sliding clamp ha una forma a ciambella che circonda il filamento neosintetizzato e mantiene in posizione la DNA polimerasi. Un complesso proteico (complesso posizionatore) catalizza l’apertura, il posizionamento e la rimozione della sliding clamp dal DNA utilizzando l’energia di idrolisi dell’ATP

32 Le proteine Sliding Clamp
La DNA polimerasi è rilasciata dal complesso innesco-stampo La DNA polimerasi si rilega allo stesso complesso e continua la sintesi del DNA In assenza di innesco-stampo la DNA polimerasi viene rilasciata dalla sliding-clamp

33 L’ATP regola l’attività della sliding clamp
Il posizionatore riconosce il complesso innesco stampo solo quando è legato all’ATP Il posizionatore apre l’anello senza idrolisi dell’ATP Qual è il ruolo dell’idrolisi dell’ATP ? l‘idrolisi dell’ATP permette il disassemblaggio del complesso Da’ il tempo alle proteine coinvolte nel processo di ritornare nella conformazione di partenza

34 La polimerizzazione del DNA
La polimerizzazione del DNA richiede: DNA polimerasi dATP, dGTP, dCTP, dTTP (i dNTPs) DNA stampo a singolo filamento Primer con un 3’-OH libero per il legame del nucleotide entrante

35 LA REPLICAZIONE DEL DNA RICHIEDE NUMEROSI ENZIMI E FATTORI PROTEICI
L’ intero complesso è detto replisoma Le elicasi si muovono lungo il DNA e separano le catene usando l’energia dell’ATP Le topoisomerasi i risolovono la tensione topologica nella struttura ad elica del DNA che si genera con la separazione delle catene. Le ssb proteine che legano il DNA a singolo filamento stabilizzano le catene separate Le primasi sintetizzano i primer (generalmente brevi frammenti di RNA). La RNasi H rimuove i primer La DNA polimerasi I sostituisce il primer con DNA. Le DNA ligasi riparano le interruzioni dei legami fosfodiesterici che rimangono dopo l’azione della DNA polimerasi I.

36 3 fasi della replicazione
Inizio: avviene in corrispondenza di uno specifico sito, ad esempio oriC in E. coli. Allungamento: movimento della forcella di replicazione Termine: avviene in corrispondenza dei siti ter in E. coli

37 Inizio della sintesi del DNA in E. coli
Nei batteri la sintesi del DNA inizia in corrispondenza di uno specifico sito chiamato ori C (per E. coli) e termina in un determinato punto: ter C nei batteri vi è un’unica origine di replicazione sia nei procarioti che negli eucarioti la replicazione è bidirezionale Ori C (origine della replicazione) L’origine è ricca in AT DNA di E. coli ter C (termine della replicazione)

38 Il modello del Replicone
Il replicone copre l’intera regione di DNA replicata a partire da una singola origine di replicazione (es. il genoma di E.coli corrisponde ad un singolo replicone). Il replicone è costitutuito da : Replicatore: l’intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l’inizio della replicazione. Iniziatore: proteina che riconosce il replicatore e attiva l’inizio della replicazione. Origine della Replicazione Sito di legame per l’iniziatore (DnaA) Siti ricchi in AT GATCTNTTNTTTT TTATCCACA Il replicone copre l’intera regione di DNA replicata a partire da una singola origine di replicazione (es. il genoma di E.coli corrisponde ad un singolo replicone). Il replicone è costitutuito da : Replicatore: l’intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l’inizio della replicazione. Iniziatore: proteina che riconosce il replicatore e attiva l’inizio della replicazione. Origine della Replicazione Sito di legame per l’iniziatore (DnaA) Siti ricchi in AT GATCTNTTNTTTT TTATCCACA Il replicone copre l’intera regione di DNA replicata a partire da una singola origine di replicazione (es. il genoma di E.coli corrisponde ad un singolo replicone). Il replicone è costitutuito da : Replicatore: l’intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l’inizio della replicazione. Iniziatore: proteina che riconosce il replicatore e attiva l’inizio della replicazione. Origine della Replicazione Sito di legame per l’iniziatore (DnaA) Siti ricchi in AT GATCTNTTNTTTT TTATCCACA I replicatori degli eucarioti multicellulari sono ancora poco noti, ma sono più complessi e con una lunghezza maggiore di 1000 bp.

39 REPLICATORE oriC in E.coli TTATCCACA Origine della Replicazione
Siti ricchi in AT GATCTNTTNTTTT Sito di legame per l’iniziatore (DnaA) TTATCCACA Origine della Replicazione Sequenza di 9 bp ripetuta 4 volte sito di legame x l’iniziatore Sequenza di 13 bp ripetuta 3 volte la doppia elica inizia a dividersi per formare il singolo filamento

40 INIZIATORE DnaA in E.coli Funzioni della proteina iniziatore La funzione dell’ Iniziatore, una volta legato al DNA è quella di reclutare le altre proteine necessarie per dare inizio al processo di replicazione. Lega specifiche sequenze di DNA all’interno del replicatore (ATP) gli elementi di 9 bp ripetuti in oriC B) Dopo legame con l’ATP deformano (aprono) la doppia elica in una regione di DNA adiacente al loro sito di legame La sequenza di 13 bp ripetuta 3 volte C) Interagiscono con fattori addizionali richiesti per l’inizio della replicazione (elicasi) Le proteine reclutate variano a seconda del tipo di proteina iniziatore L’iniziatore è la sola proteina sequenza specifica coinvolta nell’inizio della replicazione

41 Proteine necessarie per iniziare la replicazione all’origine di E.coli
Proteina P.M. Numero di subunità Proteina DnaA 52000 1 Proteina DnaB (elicasi) 300000 6 Proteina DnaC 29000 HU 19000 2 Primasi (proteina DnaG) 60000 Proteina che si lega al DNA a singola atena (SSB ) 75600 4 RNA polimerasi 454000 5 DNA girasi (DNA topoisomerasi Il) 400000 Dam metilasi 32000 Riconosce l'origine della sequenza; apre il duplex in siti specifici all’origine iniziatore Disavvolge il DNA Necessaria per il legame di DnaB a livello dell'origine Proteina istone-simile; apre il DNA; promuove l'inizio Sintetizza i primer di RNA Si lega al DNA a singola elica Facilita l'attività della DnaA Rilascia la tensione torsionale generata dallo svolgimento del DNA Metila le sequenze (5')GATC in oriC

42 INIZIO…………… Circa 20 molecole di proteina DnaA, ciascuna con un ATP si legano alle 4 sequenze ripetute di 9 coppie di basi. Il DNA è avvolto intorno a questo complesso Le 3 sequenze ripetute ricche di AT lunghe 13 coppie di basi vengono in seguito denaturate una dopo l’altra

43 …………….INIZIO Esameri di proteina DnaB si legano al complesso con l’aiuto della proteina DnaC e l’attività elicasica di DnaB disavvolge ulteriormente il DNA per prepararlo al legame con i primer e alla sintesi del DNA Due esameri di DnaB, che funzionano come elicasi, , disavvolgono il DNA in entrambe le direzioni, creando due potenziali forcelle di replicazione oriC viene metilato dall’enzima Dam metilasi nella posizione N6 dell’ adenina della palindrome GATC

44 REGOLAZIONE A LIVELLO DELL’ORIGINE
Il numero di cromosomi x cellula DEVE essere costante Come E.coli regola l’inizio di un nuovo ciclo replicativo ? La regione ori C è molto ricca in sequenze GATC (circa 11) Immediatamente dopo l’inizio della duplicazione il DNA è EMIMETILATO L’emimetilazione è utilizzata x l’interazione con la membrana plasmatica Oric si stacca dalla membrana plasmatica e……. La proteina Dna A passa ciclicamente da una forma attiva (legata ad ATP) ad una inattiva (legata ad ADP) Lo scambio di una molecola di ADP con una di ATP è un processo lento e ritarda così la formazione del complesso DnaA- ATP necessario per l’inizio della replicazione 2) prima che possa legare nuovamente DnaA oric deve essere completamente metilata

45 La metilazione del DNA regola il processo della replicazione e……..
Lo stato di emimetilazione è riconosciuto dalla proteina SeqA (forte affinità per la sequenza GATC solo quando è emimetilata ) SeqA si lega a questi siti prima che possano essere completamente metilati Riduzione drastica della velocità di metilazione di oric Impedimento del legame di DnaA su ori C e quindi dell’inizio di un nuovo ciclo replicativo il distacco casuale di seq A permette l’attacco e l’azione della metilasi dam Quando i siti GATC sono tutti metilati la DNA A può legare e avviare un nuovo ciclo di duplicazione a partire dalle ori c collocate sulle molecole di DNA neosintetizzate

46 …………….. l’espressione del gene dnaA
Anche il promotore del gene dnaA esibisce lo stesso comportamento di oriC : nello stato emi-metilato il promotore del gene dnaA è represso e così diminuisce il livello cellulare di DnaA. Dopo qualche tempo (mins), l’oriC e il promotore del gene dnaA vengono rimetilati dalla Dam metilasi. DnaA è così prodotta e la replicazione può iniziare

47 Nelle cellule in rapida crescita le origini di replicazione iniziano di nuovo la replicazione prima della divisione cellulare

48 DNA POL III oloenzima Oloenzima è un nome generico per indicare un complesso multiproteico in cui una proteina che possiede attività catalitica (core) è associata a componenti addizionali che aumentano e regolano la sua funzione Composizione della DNA pol III oloenzima a) 2 copie di DNA pol III core b) 1 copia di un complesso formato da 5 proteine γ (il posizionatore) Il complesso γ include due copie della proteina τ, ciascuna delle quali possiede un dominio di legame che interagisce con una DNA pol III core

49 La sintesi del DNA a livello della forca replicativa
per limitare lo stato a singolo filamento del DNA, particolarmente suscettibile alle lesioni, i filamenti leading e lagging vengono replicati simultaneamente dallo stesso oloenzima. L’azione coordinata delle DNA polimerasi è resa possibile dalla particolare struttura del complesso proteico della DNA polimerasi III oloenzima un ponte flessibile separa la proteina τ dal complesso γ e permette alle due molecole di core di muoversi in modo “indipendente”sul filamento veloce e su quello lento

50 MODELLO A TROMBONE La elicasi apre la doppia elica
L’oloenzima interagisce con la elicasi attraverso la proteina τ che interagisce con entrambe le Pol III core Il filamento veloce è subito copiato Il filamento lento è tenuto in “stand bay” come singolo filamento dalle SSB Ad intervalli regolari viene sintetizzato su questo filamento un’innesco che è allungato dalla La pol III core del filamento lento si stacca dal DNA ma rimanendo legata alla la proteina τ è disponibile per un altro frammento da sintetizzare Questo sistema di sintesi viene detto “MODELLO A TROMBONE” perché il laccio che si viene a formare aumenta di dimensione man mano che la sintesi procede

51 Periodicamente un primer
La sintesi del DNA a livello della forca replicativa L’azione coordinata delle polimerasi sui filamenti leading e lagging è resa possibile dalla flessibilità strutturale del DNA. La sintesi avviene simultaneamente sui due filamenti. 1 La Polimerasi della catena ritardata (filamento lagging) completa il frammento di Okazaki neosintetizzato Periodicamente un primer di RNA viene sintetizzato nel filamento lagging

52 2 La sintesi del DNA a livello della forca replicativa
La DNA polimerasi si distacca dal DNA dopo aver completato la sintesi di un filamento di Okazaki 2

53 3 4 Il complesso posizionatore (complesso γ) carica la sliding clamp (sububità β) a livello del primer più vicino. La DNA polimerasi si lega al primer più vicino e riprende la sintesi di un nuovo frammento

54 Replicazione del genoma di E. coli
Unità enzimatiche diverse sono necessarie per sintetizzare il filamento veloce e quello lento L’elicasi che crea la forcella di replicazione è connessa a due subunità catalitiche della DNA Polimerasi ciascuna delle quali è tenuta sul DNA da una pinza scorrevole (Sliding clamp) 3’ dnaB elicasi Pol III b Sliding clamp 5’ g Complesso che lega la pinza (posizionatore) La polimerasi che sintetizza il filamento veloce si muove continuamente La polimerasi che sintetizza il filamento lento si dissocia alla fine di un frammento di Okazaki

55 Replicazione del genoma di E. coli
PRIMOSOMA Unità funzionale all’interno del complesso replicativo Complesso enzimatico costituito dalla Elicasi (DnaB) e dalla Primasi (DnaG) Replicazione del genoma di E. coli 3’ dnaB elicasi Pol III b 5’ g L’elicasi separa la doppia elica del DNA a livello della forcella di replicazione e si sposta lungo il filamento stampo lento nella direzione 5’-3’ 1

56 Replicazione del genoma di E. coli
primasi 3’ 5’ La primasi DnaG si associa temporaneamente alla Dna elicasi 3

57 Replicazione del genoma di E. coli
3’ DnaG 5’ g RNA primer E’ sintetizzato un corto primer di RNA Il primer viene esteso dalla DNA pol III 4

58 Replicazione del genoma di E. coli
3’ 5’ g Lo stampo per la sintesi del filamento lagging viene tirato attraverso il primosoma creando un loop DnaG 5

59 Replicazione del genoma di E. coli
3’ 5’ g Il loop si estende 6

60 Replicazione del genoma di E. coli
2nd Core Pol III 3’ b g 5’ Quando è teminata la sintesi di un frammento di Okazaki, il nucleo della Pol III si dissocia rilasciando l’ansa 1st Core Pol III 7

61 Replicazione del genoma di E. coli
3’ 5’ g Nuovo frammento di Okazaki da sintetizzare Core Pol III 8

62 TERMINE DELLA REPLICAZIONE
Le due forcelle di replicazione del cromosoma circolare di E. coli si incontrano in una regione terminale contenente copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi detta Ter (“termine”) Quando una delle due forcelle di replicazione incontra un complesso funzionale Tus-Ter, si ferma; l’altra forcella si ferma quando incontra la prima forcella già ferma.

63 La due forcelle di replicazione si incontrano in una regione terminale contenente copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi chiamata Ter La sequenza Ter è costruita in modo da risultare in una sorta di trappola dove la forcella di replicazione può entrare ma non uscire La sequenza Ter funziona come sito di legame per la proteina Tus (terminus utilization substance) Solo un complesso Tus-Ter funziona per ogni ciclo di replicazione Quello che viene incontrato per primo da una delle due forcelle di replicazione

64 Replicazione di una molecola di DNA circolare
A replicazione avvenuta i due cromosomi figli rimangono concatenati ANELLI TOPOLOGICAMENTE INSERITI UNO NELL’ALTRO I due anelli sono avvolti insieme Ciascuno è chiuso in maniera covalente Possono essere separati solo dall’azione delle TOPOISOMERASI In E. coli la decatenazione è catalizzata dalla girasi e dalla topoisomerasi IV. I mutanti di Topo IV sono letali, infatti la girasi può sostituirla in vitro ma non in vivo.

65 L’origine di replicazione di E
L’origine di replicazione di E.coli è anche coinvolta nel processo di distribuzione dei cromosomi nelle cellule figlie 1. In una cellula batterica, il cromosoma circolare (blu) parzialmente replicato è attaccato alla membrana plasmatica attraverso le origini delle due molecole di DNA figlie. 2. Le origini dei cromosomi replicati hanno siti di attacco alla membrana indipendenti l’uno dall’altro, per cui seguono la crescita della membrana . 3. L’ origine di un setto divide la cellula , 4. ciascuna delle cellule figlie avrà un cromosoma attaccato alla membrana plasmatica.

66 FILMATO