REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR)

Presentazione sul tema: "REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR)"— Transcript della presentazione:

1 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR) Enzima DNA Polimerasi da Thermus aquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza, specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104) Componenti della PCR: DNA stampo; tampone specifico di reazione contente sali; primers (oligonucleotidi) specifici; deossinucleotidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP); Taq polimerasi La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente

2 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) +

3 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C

4 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal.

5 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C

6 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA

7 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA

8 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA

9 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA

10 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA

11 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA

12 U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) +
Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli

13 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Ad ogni ciclo di PCR il numero di molecole di DNA bersaglio (tratto di DNA incluso tra i due primer) raddoppia. In una PCR di 40 cicli per ogni molecola di DNA inizialmente presente se ne formeranno 240, cioè un numero dell’ordine di 1012.

14 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

15 1° ciclo di PCR DNA genomico DNA genomico 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’
Primer reverse Primer forward 5’ 3’ 3’ 5’ DNA genomico

16 2° ciclo di PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3° ciclo di PCR

17 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
5’ 3’ ATTCGACCT GCTACTGG 3’ 5’ CGATGACC 5’ 3’ ATTCGACCT 3’ 5’ TAAGCTGGA CGATGACC

18 Specificità dell’amplificazione:
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Specificità dell’amplificazione: 1) Primers esatti ed a singola copia. Possibilità di usare dopo anche primers più interni (nested primers); 2) Scelta della temperatura di appaiamento dei primers. In genere tra 4 - 5°C inferiore a quella di dissociazione (melting). Calcolo della temperatura di dissociazione (4°C ogni G o C, 2°C ogni A o T); 3) Concentrazione di MgCl2 nel tampone (influenza sull’appaiamento e sull’attività enzimatica): alta concentrazione di sale = bassa stringenza = minore specificità. 4) Possibilità di utilizzare in reazione DMSO, formamide o glicerolo che diminuiscono la temperatura di denaturazione e di annealing:

19 Specificità della temperatura di annealing dei primers

20 Scelta della temperatura di annealing dei primers

21 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Log [DNA] N° cicli Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile Resa teorica: 2n P =(2)n T Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza

22 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

23 Analisi dei prodotti della PCR
DNA campione 3 con inserzione interna

24 APPLICAZIONI DELLA PCR
Amplificazione a partire da 1 cellula umana = 6 pg DNA - Identificazione cellule tumorali, infezioni batteriche e virali; - diagnosi prenatale; - analisi del DNA antico; - analisi popolazionistiche (radice capello, cartellino con sangue, cellule mucosa buccale); - analisi medico-legali da tracce Amplificazione prima del clonaggio; studio di RFLP e VNTR, individuazione delle mutazioni con PCR allele specifica, RT-PCR (PCR dopo trascrizione inversa), DOP-PCR (PCR con primers degenerati).

25 PCR allele specifica

26 Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

27 1 nucleotide = 330 D = 330 x 3 x 10 –24 g. 1 cellula = 330 x 3 x 10 –24 g. x 3 x 109  3000 x  3 x  3 pg di DNA (genoma aploide) 6 pg (genoma diploide) gl. bianchi  5 x 103/l = 5 x 106/ml (in 200 l = 106 cellule) 5 ml di prelievo  25 x 106 cellule  25 x 106 x 6 pg  150 g DNA Esempio rappresentatività di un gene nel genoma: Gene globina  1,5 x 103 bp (1,5 x 103 bp : 3 x 109 = 0,00005%) Per un Southern blot 5-6 g DNA totale utilizzato = 5-6 x 10-6 g. x 0,00005% = 3 pg totali di gene della globina