25° Congresso nazionale S.I.S.A.

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1 25° Congresso nazionale S.I.S.A.
30 novembre - 2 dicembre 2011, Roma THE MEMBRANE-BOUND MERTK PROTEIN IS CLEAVED IN THE EXTRA CELLULAR DOMAIN VIA ADAM17 IN THE AREA SURROUNDING THE LIPID CORE OF HUMAN CAROTID PLAQUES U.Garbin, E.Baggio, C.Stranieri, S.Manfro, A.Pasini, G.Lipari, A.FrattaPasini, C.Mozzini, L.Cominacini Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata - Verona Dipartimento di Medicina - sez. Medicina Interna D Dott. Andrea Pasini 1

2 la lesione aterosclerotica avanzata
BACKGROUND la lesione aterosclerotica avanzata Le fasi iniziali dell’aterosclerosi sono caratterizzate da infiltrazione ed accumulo nello spazio sottoendoteliale di macrofagi ed LDL ossidate (oxLDL) Le oxLDL vengono internalizzate in notevoli quantità dai macrofagi, con formazione delle foam cells Foam cells apoptotiche vengono rimosse mediante fagocitosi (efferocitosi) Se non correttamente rimosse (efferocitosi difettiva), danno luogo a necrosi secondaria con conseguente infiammazione e formazione del core necrotico

3 i recettori dell’efferocitosi
I recettori di membrana implicati nel processo di efferocitosi e riconoscimento apoptotico sono Tyro3, Axl e Mertk (TAM receptor) La proteina ponte growth arrest-specific gene 6 (Gas6) è il principale ligando tra il gruppo TAM receptor dei fagociti ed il gruppo fosfatidilserina presente nella cellula apoptotica La metalloproteinasi domain 17 (ADAM17) è responsabile del clivaggio di diverse proteine presenti sulla superficie extracellulare, tra le quali il Mertk, con conseguente generazione della proteina solubile sMer La riduzione della porzione extracellulare dei recettori Mertk sulla superficie dei fagociti potrebbe essere responsabile dell’efferocitosi difettiva

4 efferocitosi difettiva
Gas6 Axl Tyro3 - PS Mertk Mertk Axl Tyro3 - PS Gas6 sMer Efferocitosi TAM Thorp E., JLB 2009 4

5 SCOPO DELLO STUDIO Dimostrare che la riduzione della porzione extracellulare di Mertk e l'aumento dell'ADAM17 potrebbero contribuire all'efferocitosi difettiva nelle placche aterosclerotiche carotidee umane studio ex vivo in placche aterosclerotiche carotidee confronto tra area circostante il core lipidico (LC) e porzioni periferiche (P) della lesione studio in vitro stimolazione di cellule macrophage-like THP-1 mediante estratto di placche aterosclerotiche da aree circostanti il core lipidico (PE) 5

6 MATERIALI E METODI analizzate 97 placche carotidee umane da pazienti sottoposti ad intervento chirurgico di TEA carotidea zona PERIFERICA (P) direzione vaso CORE (LC) - cappuccio fibroso sottile (<200 µm) elevata infiltrazione macrofagi presenza core lipidico

7 principali metodiche utilizzate
Analisi immunoistochimica: Ab monoclonali anti Mertk e ADAM17 (Abcam) Estrazione RNA: quantificazione (Agilent) e Real-Time PCR (SyBR Green) di - Metalloproteinasi (ADAM17) - Recettori-ligandi (Mertk, Axl, Tyro3, GAS6) Analisi di Western Blotting Silenziamento genico: ADAM17 siRNA (Qiagen) Analisi citofluorimetrica: Mertk e ADAM17 Estrazione solido-liquido: estratto di placca (PE) da omogenato di lesioni aterosclerotiche carotidee

8 RISULTATI Espressione genica e proteica nelle placche carotidee umane.
Confronto tra core lipidico (LC) e zona periferica (P) della placca dei recettori Mertk, Axl, Tyro3, Gas6 e ADAM17 proteina target beta-actina Nel confronto LC e P, aumentata in modo significativo l’espressione genica di…. Confermato da analisi proteica di WB * p<0.01 di LC versus P 8

9 Analisi immunoistochimica di ADAM17 e Mertk nelle lesioni carotidee umane
FC = cappuccio fibroso LC = core lipidico LC C FC 1st 2nd 3rd 4th 5th B LC *p<0.01 versus 1° quintile †, ‡, § p<0.01 versus 2°, 3° e 4° quintile FC 1st 2nd 3rd 4th 5th

10 Stimolazione con estratto di placca (PE) di cellule THP-1
Espressione genica e proteica di Mertk, Axl, Tyro3, Gas6 e ADAM17 proteina target beta-actina L’analisi biomolecolare delle cells stimolate ha evidenziato un aumento significativo….. *p<0.01 versus cellule non stimolate (-PE) 10

11 Time-course di Mertk e ADAM17 e silenziamento del gene ADAM17
Analisi citofluorimetrica di cellule THP-1 stimolate con estratto di placca (PE) Time-course di Mertk e ADAM17 e silenziamento del gene ADAM17 Nell’analisi citofluorimetrica delle 2 proteine di superficie si può notare…. Quindi per verificare se effettivamente ci può essere una ridotta disponibilità del R a causa di un clivaggio del dominio extracell abbiamo effettuato un’analisi proteica del medium di coltura * p<0.01 versus basale † p<0.01 versus THP-1 stimolate con PE 4h * p<0.01 versus basale ‡ p<0.01 versus THP-1 stimolate con PE 24h 11

12 Analisi Western-blotting di cellule THP-1 stimolate con
estratto di placca (PE) Espressione proteica di Mertk e sMer * p<0.01 versus basale (cellule non stimolate) ‡ p<0.01 versus cellule stimolate, non silenziate (+CsiRNA +PE 24 h)

13 CONCLUSIONI 1 Studi ex-vivo hanno dimostrato:
- Mertk e ADAM17 sono maggiormente espressi nell’area attigua il core lipidico rispetto ad aree periferiche - nelle aree circostanti il core lipidico è stata evidenziata una relazione inversa tra l'espressione proteica di Mertk e ADAM17 Studi in vitro: - la stimolazione di cellule THP-1 con estratto di placca aumentavano significativamente l'espressione proteica di ADAM17 mentre Mertk, dopo iniziale incremento, si riduceva con relativo aumento della porzione solubile sMer nel medium di coltura - il silenziamento di ADAM17 aboliva la riduzione del recettore Mertk e il rilascio del recettore sMer solubile

14 CONCLUSIONI 2 Il presente lavoro dimostra che una l'aumentata espressione di ADAM17 conduce ad una riduzione della porzione extracellulare del recettore Mertk. Questo potrebbe contribuire all’efferocitosi difettiva e alla necrosi secondaria con espansione del core lipidico

15 ringrazio per l'attenzione