Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto

Presentazione sul tema: "Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto"— Transcript della presentazione:

1 Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto
Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione (A.A. 2016/17) Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto Corso di Biotecnologie della Riproduzione Animale Prof.ssa M.E. Dell’Aquila

2 Sommario (1) Aspetti storici Lo sviluppo embrionale nell’ovidutto
La coltura dell’embrione in vivo Metabolismo dell’embrione precoce e blocco dello sviluppo (test metabolici) Sistemi di coltura in vitro Medium chimicamente definiti e semi-definiti

3 Sommario (2) La co-coltura
(cellule epiteliali oviduttali, cumulo ooforo, granulosa, cellule uterine, vescicole trofoblastiche, Vero cells, BRL=Buffalo rat liver cells) I terreni di coltura pre-condizionati Ormoni, fattori di crescita, citochine nella coltura embrionale in vitro La valutazione morfologica dell’embrione (Criteri delle società scientifiche internazionali)

4 Aspetti storici Sreenan, 1968; Sreenan e Scanlon, 1968 Adams, 1968
(primi reports di una procedura di coltura in vitro dell’embrione precoce bovino fino allo stadio di blastocisti) Adams, 1968 (primo report di una procedura di coltura in vivo dell’embrione precoce bovino in ovidutti di coniglia fino allo stadio di hatching blastocyst) Gandolfi, 1986; Gandolfi e Moor, 1987 (primi reports di una procedura di coltura in vitro dell’embrione precoce bovino fino allo stadio di blastocisti su monostrato di cellule epiteliali oviduttali) Avvio studi interazioni biochimiche ovidutti-embrione

5 Sviluppo dell’embrione pre-impianto
Il microambiente oviduttale Divisioni embrionali e compattazione dell’embrione Trasformazione della morula in blastocisti Mortalità embrionaria

6 Lo sviluppo dell’embrione nell’ovidutto
Immagine percorso in ovidutto

7 Stadi di sviluppo dell’embrione bovino

8 Stadi di sviluppo dell’embrioneumano

9 Stadi di sviluppo dell’embrione umano
2PB 2PN 4 cellule 8 cellule morula blastocisti

10 L’Hatching

11 L’impianto dell’embrione
alla parete uterina

12 Arrivo in cavità uterina e impianto nelle diverse specie
Arrivo (giorni) Impianto (giorni) Bovina 3-4 12 Cagna 5-8 13-17 Gatta Pecora 3 15 Cavalla 5-6 25-30 Scrofa 2 Umana 4

13 Cause di mortalità embrionaria nei ruminanti domestici
Diagramma cause di mortalità embrionaria

14 Metabolismo dell’embrione precoce e blocco dello sviluppo
Attivazione del genoma embrionale

15 Attivazione del genoma embrionale
L’attivazione del genoma embrionale inizia in fasi diverse nelle varie specie: Topo, Capra, Criceto: 2 cellule Bovini, Ovini: 8-16 cellule Suini: 4 cellule Uomo: 4-8 cellule

16 Esiste una gerarchia di geni regolatori dello sviluppo embrionale:
Differenziamento Esiste una gerarchia di geni regolatori dello sviluppo embrionale: Geni ad effetto materno (si esprimono nelle fasi comprese tra la maturazione e le prime divisioni embrionali) Geni gap (funzioni del nucleo, elementi del citoscheletro, canali di membrana, trasportatori di ioni, proteine di superficie o secrete, fattori di crescita e loro recettori) Geni per la segmentazione e polarità dell’embrione (geni che controllano il pattern di formazione dell’asse antero-posteriore dell’embrione) Geni omeotici (specificazione dei segmenti, contengono homeo-box) Geni tessuto-specifici

17 Sistemi di coltura in vivo
Ovidutto di coniglia Ovidutto di pecora Ovidutto di bovina Sistema di coltura in ovidutti isolati Sistema di coltura in embrioni di pollo

18 Sistemi di coltura in vitro
Uso di terreni di coltura convenzionali Fattori importanti (fase gassosa, luce, temperatura, controllo qualità terreno, tossicità del O2 Supplementazione con siero Uso di sostituti del siero (BSA, PVP, PVA..) Formulazioni del SOF (synthetic oviductal fluid) Uso di terreni chimicamente definiti Uso di terreni pre-condizionati

19 La co-coltura con cellule oviduttali
Flushing degli ovidutti Trasporto degli ovidutti Problemi coltura cellule oviduttali: - frequenti contaminazioni - rapido dedifferenziamento

20 Il setting-up del monostrato
di cellule oviduttali 1. Il flushing degli ovidutti

21 Il setting-up del monostrato di cellule oviduttali
Nel giorno dell’ IVM allestire piastre Petri da 30 mm contenenti microgocce da 25 ml di terreno di coltura embrionale ricoperte di paraffina liquida Aggiungere cellule oviduttali Cambio di terreno ogni 48h (50%)

22 La cocoltura con cellule non oviduttali
Vantaggi e svantaggi Monostrati di cellule del cumulo ooforo o granulosa Uso di cellule in sequenze particolari Coltura con vescicole trofoblastiche

23 Uso dei terreni precondizionati
Terreni precondizionati attraverso breve esposizione a cellule oviduttali/uterine o a cellule di granulosa/cumulo ooforo o a vescicole trofoblastiche

24 Ormoni, fattori di crescita e citochine nella coltura embrionale
Insulina EGF, IGF-I, IGF-II, TGF, PDGF LIF, Interleukin 6

25 Metodi per la valutazione della qualità embrionaria
Analisi morfologica e morfometrica Età dell’embrione e stadio di sviluppo Conta del numero di blastomeri e nuclei Hatching

26 Valutazione morfologica
Blastomeri regolari/assenza frammenti Blastomeri reg-irreg/molti frammenti Blastomeri regolari/alcuni frammenti Pochi blastomeri/severa frammentazione Blastomeri irregolari

27 Test metabolici (valutazione vitalità embrionaria)
LDH Uptake di Glucosio, Glutamina, Piruvato

28 Letture consigliate “Culturing and evaluating the early embryo” in: Gordon I. Laboratory production of cattle embryo. CABI publications Chap