Espressione Genica Informazione contenuta nei geni (DNA) viene decodificata prima in RNA (Trascrizione) e successivamente in proteine (Traduzione)

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1 Espressione Genica Informazione contenuta nei geni (DNA) viene decodificata prima in RNA (Trascrizione) e successivamente in proteine (Traduzione)

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3 Nucleotidi e Ribonucleotidi

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7 L’RNA è costituituito da un singolo filamento
ripiegato in strutture specifiche

8 RNA polimerasi Batterica
RNA polimerasi DNA-dipendenti MA NON NECESSITANO DI INNESCO per avviare la trascrizione nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ difosfato + RNAn+1 Procede in direzione 5’-3’

9 Polimerizzazione dei ribonucleotidi ad opera dell’RNA polimerasi durante la trascrizione
L’RNA polimerasi catalizza un legame fosfodiestere tra il gruppo 3’OH libero dell’RNA nascente ed il fosfato in alfa del nuovo ribonucleotide

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11 Stadi della Trascrizione
Fase di inizio Fase di allungamento Fase di Terminazione

12 RNA polimerasi batterica
Apoenzima dotato di attività catalitica: 2 subunità a, b e b’ Oloenzima: Apoenzima + subunità s

13 Ciclo di trascrizione dell’RNA polimerasi batterica
1) L’oloenzima si lega al promotore 2) La polimerasi denatura il DNA al sito di inizio della trascrizione. 3) La polimerasi inizia a trascrivere (Trascrizione Abortiva) 4-5) Si stacca s e la polimerasi diventa più processiva (Fase di Allungamento) 6-7) In presenza di segnali (Terminatori) avviene il distacco della polimerasi dal DNA ed il rilascio di RNA

14 Sequenze Consenso per i prinicipali Promotori Batterici

15 La direzione dell’RNA polimerasi è determinata dall’orientamento del promotore
L’ RNA polimerasi procede sempre in direzione 5’-3’

16 Esistono tre tipi di RNA polimerasi eucariotiche
RNA polimerasi DNA-dipendenti MA NON NECESSITANO DI INNESCO per avviare la trascrizione Esistono tre tipi di RNA polimerasi eucariotiche

17 1) Richede l’intervento dei fattori trascrizionali basali
L’RNA polimerasi II è molto simile all’RNA polimerasi batterica ma ci sono delle differenze 1) Richede l’intervento dei fattori trascrizionali basali 2) Tiene conto del compattamento del DNA nei nucleosomi I fattori trascrizionali basali, aiutano l’RNA polimerasi II a posizionarsi correttamente sul promotore. Svolgono una funzione analoga alla subunità s dell’RNA polimerasi batterica

18 Fasi di inizio della trascrizione eucariotica
I promotori eucariotici contengono una sequenza consensus chiamata TATA box La TATA box è riconosciuta e legata da TFIID TFIID è costituita da varie subunità: TBP e TAFs TBP è responsabile del riconoscimento della TATA box TFIIB riconosce e lega l’elemento BRE del promotore

19 TFIIF stabilizza l’interazione dell’RNA polimerasi II con TFIID e TFIIB e recluta TFIIE
TFIIE recluta TFIIH

20 TFIIH è dotata di attività elicasica e di fosforilazione del dominio CTD (C-terminal domain) dell’RNA polimerasi II La fosforilazione del dominio CTD (C-terminal domain) avviene al livello della serina 5

21 Ruoli dei fattori trascrizionali basali

22 Figure 6-17 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

23 Acetilazione Istoni H3 ed H4 (Attivazione genica)
Modifiche post-traduzionali delle code delle proteine istoniche possono influenzare l’espressione genica Acetilazione Istoni H3 ed H4 (Attivazione genica) Metilazione Istone H3 (Inattivazione genica) De-acetilazione Istone H3 ed H4 (Inattivazione genica)

24 Acetilazione, metilazione e fosforilazione degli istoni

25 Fattori Trascrizionali
Posseggono delle particolari regioni (motivi) che legano il DNA Stabiliscono un gran numero di contatti con il DNA, coinvolgendo legami idrogeno, legami ionici ed interazioni idrofobiche Tali legami determinano un’interazione con il DNA molto forte ed altamente specifica I motivi sono generalmente costituiti da alfa eliche e foglietti beta

26 Motivo ELICA-GIRO-ELICA
L’alfa-elica C-terminale (Rosso) si lega in modo sequenza specifica al livello del solco maggiore del DNA

27 Motivo a dita di Zinco

28 Motivo a cerniera di leucine (“Leucine Zipper”)

29 Motivo Elica-Ansa-Elica
Tale motivo consiste di una breve alfa-elica connessa da un’ansa ad una seconda alfa-elica più lunga. La flessibilità dell’ana permette ad un’elica di ripiegarsi e di compattarsi contro l’altra. L’elica più lunga di solito è responsabile dell’interazione con il DNA

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31 Dal Gene alla Proteina nei Procarioti ed Eucarioti

32 Differenze tra i trascritti procariotici e i trascritti eucariotici

33 Aggiunta del Cappuccio al 5’ dell’mRNA
Fosfatasi Guanilil-Transferasi 7-Metil-Transferasi

34 Disposizione di Esoni ed Introni in differenti geni

35 Processo di Splicing

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37 1° Reazione di Transesterificazione

38 2° Reazione di Transesterificazione

39 …Ricapitolando

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43 Figure 6-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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45 Sequenze consensus che dirigono il taglio e la poli-Adenilazione del 3’ del trascritto

46 Passaggi principali nella generazione dell’estremità 3’ di un mRNA eucariotico
1) Legate al CTD della pol II ci sono CPSF (Fattore della specificità del taglio e della poli-Adenilazione) e CsTF (Fattore di stimolazione del taglio) 2) CPSF riconosce il consenus AAUAAA; CstF richiama altri fattori di taglio che determinano il taglio del trascritto al sito CA 3) L’enzima PoliA-polimerasi (RNA polimerasi stampo-indipendente) catalizza l’aggiunta di una coda di A (circa 250 nucleotidi) al gruppo 3’OH libero del dinucleotide CA al sito di taglio 4) La coda di poli-A viene riconosciuta e legata dalle PolyA-binding protein che stabilizzo il trascritto ed impediscono che venga degradato da RNasi

47 Figure 6-38 (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

48 Figure 6-38 (part 2 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

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52 Regolazione del recettore della transferrina
Regolazione della ferritina Regolazione del recettore della transferrina

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54 I trascritti dopo aver subito le modifiche del:
Aggiunta del Cap di 7-metil Guanosina al 5’ Splicing Aggiunta di coda di poli-A Vengono esportati dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari

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56 Processamento degli RNA ribosomali
L’RNA polimerasi I trascrive il gene che codifica per gli rRNA 28S, 18S, 5.8S Tale gene codifica per un grosso trascritto precursore 45S che viene processato in 28S, 18S e 5.8S

57 Biogenesi dei microRNA
I geni codificanti microRNA sono trascritti dall’ RNA polimerasi II oppure III Il trascritto contiene una o più regioni stem-loop chiamati pri-micorRNA I pri-microRNA sono processati dal complesso Drosha/DGCR8. Viene quindi liberata una struttura stem loop di nucleotidi chiamata pre-microRNA I pre-microRNA sono esportati dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari mediante un meccanismo dipendente da Exportin5 e RAN-GTP I pre-microRNA sono processati nel citoplasma dal complesso Dicer/TRBP che forma una regione di dsRNA di nucleotidi con le estremità 3’ sporgenti di due nucleotidi.

58 Il microRNA maturo viene incorporato nel complesso RISC (RNA-induced silencing complex)
Nel complesso RISC viene mantenuto solo 1 filamento di RNA derivante dalla struttura di dsRNA (microRNA maturo). Questo indirizzerà il complesso RISC sull’ mRNA bersaglio. Nel caso di un appaiamento perfetto tra microRNA e mRNA (si verifica per lo più nelle piante), l’mRNA bersagli viene degradato dalle proteine Argonauta presenti nel complesso RISC Nel caso di un appaiamento non perfetto si verifica un blocco traduzionale dell’mRNA bersaglio

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60 Codice genetico Il codice è letto in gruppi di tre nucleotidi (triplette) Ciascuna tripletta sull’mRNA è chiamato codone Il codice è ridondante: codoni diversi possono codificare per un singolo amminoacido

61 Per una data sequenza di RNA ci sono tre differenti quadri di lettura
MA solo un quadro di lettura possibili in un mRNA codifica per una proteina!!!

62 Struttura del tRNA

63 Appaiamento codone-anticodone
Fenomeno del vacillamento La terza base è oscillante

64 Come si forma amminoacil-tRNA?
Avviene ad opera dell’Amminoacil-tRNA sintetasi mediante un processo a 2 fasi: 1) Attivazione degli amminoacidi 2) Formazione del legame esterico tra il gruppo carbossilico dell’amminoacido ed il 3’OH libero dell’adenina al livello del CCA all’estremità 3’ del tRNA

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66 1 errore ogni 50000 accoppiamenti
Meccanismo di controllo dell’amminoacil-tRNA sintetasi 1 errore ogni accoppiamenti Viene idrolizzato l’AMP dall’amminoacido non corretto e l’amminoacido viene espulso dal sito attivo dell’enzima Meccanismo analogo alla correzione esonucleolitica della DNA polimerasi

67 Incorporazione di un amminoacido in proteina
1) Attivazione degli amminoacidi Il legame ad alta energia tra il tRNA e l’amminoacido viene rotto ed il gruppo carbossilico così liberato forma un legame peptidico con il gruppo amminico libero dell’amminoacido successivo. Tale reazione è catalizzata dall’enzima peptidil-transferasi

68 Il messaggio contenuto nell’RNA è decodificato dai ribosomi

69 Ribosoma contiene quattro siti fondamentali: per mRNA, per amminoacil-tRNA, per peptidil-tRNA e sito di uscita per i tRNA “scaricati”

70 La reazione centrale della sintesi proteica è catalizzata dall’enzima peptidil-transferasi

71 1) L’amminoacil tRNA si lega al sito A del ribosoma
2) Formazione del legame peptidico catalizzata dalla peptidil-transferasi

72 3) La subunità maggiore del ribosoma trasloca rispetto alla subunità minore. Ciò porta il peptidil-tRNA al livello del sito A e il tRNA “scaricato” al livello del sito E nella subunità maggiore (posizione ibrida)

73 4)La subunità minore si sposta di una tripletta lungo l’mRNA
4)La subunità minore si sposta di una tripletta lungo l’mRNA. Ora il peptidil-tRNA è passato completamente nel sito A e il tRNA “scaricato” nel sito E

74 5) Un nuovo amminoacil-tRNA entra nel sito A mentre il tRNA scaricato esce dal sito E

75 Il processo di traduzione è finemente regolato
EF-Tu-GTP lega e “controlla” che gli amminoacil-tRNA siano corretti. Inoltre, li guida al livello del sito A

76 EF-Tu induce una curvatura al tRNA per cui impedisce che possa formarsi un appaiamento incorretto

77 Al corretto appaiamento tra codone ed anticodone segue l’idrolisi del GTP a GDP.
Ciò determina un cambio conformazionale di EF-Tu che determina la perdita di affinità verso l’amminoacil-tRNA ed il distacco dall’amminoacil-tRNA

78 I passaggi di correzione garantiscono una traduzione accurata al 99,99%

79 Fase di inizio della traduzione
Il cap al 5’ e la coda di polyA del trascritto sono fondamentali per una corretta traduzione

80 Alla subunità minore del ribosoma si lega al livello del sito P il tRNA iniziatore che porta legato una Metionina La subunità minore scorre lungo l’mRNA alla ricerca del codone AUG Una tipica sequenza consensus di inizio della traduzione è ACCAUGG Fenomeno leaky scanning

81 Nei batteri il tRNA iniziatore porta una Metionina modificata
(Formil-Metionina)

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86 Fase di terminazione della traduzione
Quando un codone di stop viene “letto dal ribosoma” si posizionano nel sito A del ribosoma i Fattori di rilascio della traduzione (RF) Codoni di stop: UAA, UAG, UGA

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92 Ulteriore meccanismo di controllo traduzionale
mRNA nonsense decay Un corretto splicing determina il legame sull’RNA delle proteine EJC Se il ribosoma incontra un codone di stop quando sono presenti sull’ mRNA proteine EJC queste reclutano le proteine Upf che scatenano una reazione di degradazione dell’mRNA