MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici Isotopo Emivita Tipo di emissione Energia di emissione 3H.

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1 MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici Isotopo Emivita Tipo di emissione Energia di emissione 3H anni beta MeV 32P giorni beta MeV 33P giorni beta MeV 35S giorni beta MeV Marcatura con 3H :nucleotide con isotopo in posizioni diverse Marcatura con 32P, 33P: nucleotidi con l’isotopo nel gruppo fosfato in  (marcatura interna); un nucleotide con l’isotopo nel gruppo fosfato in  che viene sostituito dal P del nucleotide terminale (marcatura terminale con chinasi) Marcatura con 35S: inserito nucleotide con l’isotopo 35S al posto dell’O- del gruppo fosfato in posizione 

2 MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM PRIMING”
Klenow: subunità della DNA polimerasi I di E.coli. Attività endonucleasica 5’ 3’ no esonucleasica 5’ 3’ (distruggerebbe primer) si esonucleasica 3’ 5’

3 MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM PRIMING”

4 MARCATURA TERMINALE DEL DNA MEDIANTE POLINUCLEOTIDE CHINASI

5 MARCATURA NON ISOTOPICA
- Diretta: incorporazione di nucleotidi modificati contenenti un fluoroforo (gruppo chimico che emette fluorescenza se esposto a certe lunghezze d’onda) - Indiretta: incorporazione di un nucleotide al quale è stato legato un gruppo indicatore (R); individuazione dell’ibridazione della sonda per riconoscimento di (R) da parte di un “anticorpo” (A) che viene evidenziato con un marcatore (M) Digossigenina (steroide vegetale) e biotina (vitamina B7) hanno un gruppo indicatore (incorporato nell’acido nucleico) che può essere riconosciuto da ligandi specifici. Esempi: La biotina viene legata dall’avidina (glicoproteina presente nell’albume dell’uovo) legata a marcatore fluorescente saggio fluorimetrico; La digossigenina viene legata da un anticorpo monoclonale coniugato con la fosfatasi alcalina saggio enzimatico con conversione di un substrato incolore

6 Fluorofori per la marcatura non isotopica diretta
dUTP Fluorescin-dUTP (verde) Rhodamine-dUTP (rosso)

7 Marcatura non isotopica indiretta

8 Marcatura non isotopica indiretta
Deossiuridina trifosfato (dUTP) modificata con Biotina, ibridazione con Avidina accoppiata con marcatore fluorescente Marcatura non isotopica indiretta Sonda DNA complessata con perossidasi di rafano (Horseradish peroxidase, HP) + luminolo: sviluppo di chemioluminescenza rilevata con autoradiogramma

9 Utilizzo delle sonde marcate per:
Ibridazione degli acidi nucleici: DNA, RNA Southern blot (in genere: marcatura isotopica) Northern blot (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione di filtri con colonie (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione in situ di cromosomi per mappatura citogenetica (ora non isotopica) Ibridazione in situ di tessuti (ora non isotopica) Ibridazione di filtri con spot di DNA da PCR (dot blot)

10 Ibridazione con una sonda molecolare

11 Ibridazione con una sonda molecolare

12 IBRIDAZIONE DI UN SOUTHERN BLOT
Specificità dell’ibridazione: Temperatura di ibridazione Concentrazione salina Temperatura lavaggi

13 IBRIDAZIONE DI UN NORTHERN BLOT

14 IBRIDAZIONE DI FILTRI CON COLONIE

15 Preparazione di sonde marcate di RNA: Riboprobes

16 IBRIDAZIONE IN SITU su campione intero
Espressione di un gene per la crescita dei fibroblasti nell’embrione di pollo. Trascritti marcati con sonda antisenso marcata con digossigenina e rilevati con anticorpi antidigossigenina accoppiati a fosfatasi alcalina

17 IBRIDAZIONE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE SU DOT BLOT

18 MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU
DI SONDE MARCATE Procedura sperimentale: Mitosi fissate su vetrino Parziale deproteinizzazione con proteasi Denaturazione ad alte temperature (90-100°C) Ibridazione con sonda denaturata e marcata con isotopo radioattivo (o colorante fluorescente) Lavaggi Esposizione con lastra autoradiografica e sviluppo se sonda radioattiva Svantaggi dell’uso di tritio: Utilizzo del radioattivo Bassa risoluzione (diffusione della radiazione ed alto background) Bassa sensibilità

19 MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU

20 MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU
Localizzazione diretta di sonde su cromosomi metafasici Posizionamento contemporaneo di più sonde lungo i cromosomi Localizzazione di sonde rispetto a bande e strutture conservate (centromeri e telomeri)

21 Ibridazione in situ fluorescente
Fluorescent In Situ Hybridization: FISH Ibridazione in situ fluorescente - Metodo diretto: Marcatura della sonda con nucleotidi coniugati a fluorocromi - Metodo indiretto: Riconoscimento della sonda con una seconda sonda marcata con fluorocromi Visualizzazione diretta al microscopio a fluorescenza FISH SU CROMOSOMI METAFASICI (Risoluzione 1 Mb) FISH SU CROMOSOMI INTERFASICI (Risoluzione tra Kb) - FISH SU CROMOSOMI IN INTERFASE ARTIFICIALE ( Kb) (Fiber FISH)

22 MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
dUTP Fluorescin-dUTP (verde) Rhodamine-dUTP (rosso)

23

24 FISH Ibridazione con sonda che copre il sito di rottura cromosomica

25 FISH MULTICOLORE - Utilizzo sostanza fluorescenti con diverso spettro di emissione (FITC, fluorescina isotiocianato, Texas Red, rodamina) - Utilizzo contemporaneo di sonde marcate con diversa localizzazione lungo il cromosoma

26 FISH MULTICOLORE

27 CHROMOSOME PAINTING - Sonde: collezione di frammenti specifici di ogni cromosoma - Ogni cromosoma risulta fluorescente ed ha un colore diverso - Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dell’immagine - Cariotipo molecolare (spectral karyotype SKY)

28 FISH MULTICOLORE Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma Cromosomi fluorescenti con colori diversi Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dell’immagine

29 Chromosome painting FISH multicolore