UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FOGGIA

Presentazione sul tema: "UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FOGGIA"— Transcript della presentazione:

1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FOGGIA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO E DEL NIVALENOLO NEI CEREALI MEDIANTE HPLC E RIVELAZIONE FLUORIMETRICA CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Marilena Muscarella a,*, Sonia Lo Magro a, Marco Iammarino a, Donatella Nardiello a, Carmen Palermo b, Diego Centonze b a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia; b Dipartimento di Scienze Agro-Ambientali, Chimica e Difesa Vegetale, Università degli Studi di Foggia * Introduzione Tra le micotossine prodotte dai funghi del genere Fusarium, i tricoteceni rappresentano il gruppo più numeroso con più di 140 tossine, suddivise in 4 sottogruppi principali, indicati come tipo A, B, C e D. Il deossinivalenolo (DON) e il nivalenolo (NIV) appartengono al gruppo B. Si tratta di micotossine diffuse abbondantemente nei cereali, responsabili di varie tossicosi, quali rifiuto del cibo, disturbi gastrointestinali e dermatiti [1,2]. A livello europeo, solo per il DON sono stati definiti limiti massimi consentiti, pari a 1.75 mg/kg nel frumento duro, mais ed avena, utilizzati come materie prime nella preparazione dei mangimi, e a 0.75 mg/kg nei cereali destinati al consumo umano diretto [3]. Per la determinazione del DON e NIV, è stato messo a punto ed ottimizzato un metodo analitico basato sulla cromatografia liquida a fase inversa e la rivelazione fluorimetrica. Poiché il DON e NIV mancano di gruppi cromofori e non sono naturalmente fluorescenti, tale metodo prevede un processo di derivatizzazione chimica post-colonna, mediante idrossido di sodio e metilacetoacetato/acetato di ammonio. In tal modo, i prodotti di derivatizzazione vengono inviati rapidamente al rivelatore fluorimetrico, evitando le limitazioni proprie della derivatizzazione pre-colonna e consentendo una determinazione accurata a bassi livelli di concentrazione. Materiali e Metodi Le analisi cromatografiche sono state condotte utilizzando un cromatografo Agilent SL 1200, corredato di rivelatore fluorimetrico. Prima dell’analisi, ogni campione è finemente omogeneizzato e le micotossine sono estratte con acqua. Dopo centrifugazione e filtrazione, l’estratto è purificato mediante estrazione in fase solida. Il processo di derivatizzazione chimica post-colonna è eseguito utilizzando dispositivi disponibili in commercio (LabService Analytica S.r.l., Bologna, Italia) costituti da due pompe a doppio pistone collegate alle riserve di agenti derivatizzanti, e di una doppia camera di reazione termostata (modello Pickering PCX 5200) . Figura 2. Rappresentazione schematica dell’apparato strumentale HPLC/FLD con derivatizzazione chimica post-colonna a doppia camera di reazione. Figura 1. Reazione di derivatizzazione del DON (R=H) e NIV (R=OH) [4]. Risultati e Discussione Per la fase di preparazione del campione, sono stati condotti studi di ottimizzazione della composizione della miscela estraente delle micotossine dalla matrice e della procedura di estrazione in fase solida, utilizzando differenti tipologie di cartucce SPE (multifunzionali, C18, immuno-affinità, silica-gel). I risultati migliori in termini di recupero e riproducibilità sono stati ottenuti utilizzando cartucce OASIS® (HLB, Waters) ad interazione mista idrofobica-idrofilica. Nelle condizioni cromatografiche ottimizzate, si ottiene una buona separazione del DON e NIV in meno di 20 minuti di analisi. La combinazione di una semplice procedura di clean-up con la derivatizzazione chimica post-colonna abbinata alla rivelazione fluorimetrica consente di ottenere una elevata affidabilità e sensibilità di analisi con limiti di rivelabilità inferiori a 14 µg/kg. a y è il segnale espresso in unità di luminescenza (LU); x è il valore della concentrazione in mg/L. b Coefficiente di correlazione. c Limite di rivelabilità e quantificazione (mg/kg) valutati dal cromatogramma del frumento duro additivato a mg/kg, ad un rapporto segnale-rumore pari a 3 e 10, rispettivamente. Figura 4. Profilo cromatografico di un campione di mais, bianco (a) ed additivato (b) con DON e NIV alla concentrazione totale di 1.5 mg/kg. Figura 3. Soluzione standard di DON e NIV alla concentrazione di 1 mg/kg ciascuno. Validazione del Metodo Il metodo analitico proposto è stato sottoposto a procedura di validazione, in accordo con quanto indicato nel Reg. 882/2004/CE e nella Decisione 657/2002/CE, su campioni di cereali, sia destinati al consumo umano diretto che al settore zootecnico. Sono stati valutati i parametri analitici di linearità, specificità, precisione, recupero, robustezza, limite di rivelabilità e quantificazione, ed è stata verificata la rispondenza delle prestazioni analitiche del metodo al Regolamento 401/2006/CE che definisce i criteri di rendimento dei metodi di determinazione delle micotossine. Conclusioni Per la determinazione del DON e NIV nei prodotti alimentari e nei cereali destinati al settore zootecnico è stato messo a punto ed ottimizzato un metodo analitico, rapido e sensibile, basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni e la rivelazione fluorimetrica, previa derivatizzazione chimica post-colonna con idrossido di sodio e metilacetoacetato/acetato di ammonio. Il processo di derivatizzazione assicura semplicità di analisi ed un alto grado di automazione. La buona sensibilità della risposta analitica permette di raggiungere limiti di quantificazione che sono ben al di sotto dei limiti di legge stabiliti per il deossinivalenolo. La procedura di validazione del metodo proposto ha dimostrato la rispondenza dei requisiti analitici ai criteri previsti dal Regolamento 401/2006/CE, confermando l’affidabilità del metodo nelle analisi ufficiali dei prodotti alimentari e dei cereali utilizzati nella produzione di mangimi. Riferimenti bibliografici H.P. van Egmond, G.J.A. Speijers Natural Toxins I. Mycotoxins. In: K. Van der Heijden, M. Younes, L. Fishbein, S. Miller. International food safety handbook. New York: Marcel Dekker Inc. (1999). R. Krska, S. Baumgartner, R. Josephs. Fresenius J. Anal. Chem. 371 (2001) European Commission, Regulation (EC) No 1881/2006. Off. J. Eur. Union L 364, 5-24. A. Sano, S. Matsutani, M. Suzuki, S. Takitani. J. Chromatogr. A 410 (1987) Lavoro eseguito con i fondi di ricerca corrente del Ministero della Salute (Progetto RC–IZS PB xxxxxx). Si ringrazia P. D’Antini (Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata – FOGGIA) per la collaborazione tecnica.