Listeria monocytogenes

Presentazione sul tema: "Listeria monocytogenes"— Transcript della presentazione:

1 Listeria monocytogenes
Valutazione della sicurezza microbiologica di alimenti fermentati mediante Real-Time PCR Franco Dellaglio 1, Albino Poli 2, Elena Guglielmini 1, Silvia Sembeni 2, Massimiliano Spiazzi 1, Franca Rossi 1 e Sandra Torriani 3* 1 Dipartimento Scientifico e Tecnologico; 2 Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica; 3 Dipartimento di Scienze, Tecnologie e Mercati della Vite e del Vino; Università degli Studi di Verona; * PREMESSA. Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shighella spp., Staphylococcus aureus e Yersinia enterocolitica sono batteri patogeni responsabili di molti dei casi di infezione o tossinfezione alimentare correntemente denunciati e accertati mediante esami di laboratorio. I metodi ufficiali per il loro rilevamento consistono in test colturali con tempi di risposta lunghi e scarsa selettività, ma anche con condizioni di crescita troppo sfavorevoli per permettere il recupero di tutti i biotipi, di cellule danneggiate ma ancora vitali o di cellule con inalterata capacità patogenica ma incapaci di accrescersi in piastra. Ciò si traduce in un ritardo di immissione sul mercato quando questi metodi sono utilizzati in procedure di autocontrollo aziendale. In tale quadro si evidenzia la necessità di validare e standardizzare nuovi approcci diagnostici basati sulla PCR per la rapida e affidabile individuazione di contaminazioni microbiche nella filiera di produzione degli alimenti. SCOPO. Questa indagine ha avuto lo scopo di esplorare le potenzialità applicative della tecnica Real-Time PCR per rilevare i patogeni menzionati in campioni di formaggi tipici (Monte Veronese) e salumi tradizionali (Soppressa Veneta). METODI. Per ciascuna specie o gruppo di specie è stata disegnata una nuova coppia di primer specifici, secondo i requisiti per l’uso nella Real-Time PCR. I geni target sono stati scelti tra quelli legati alla patogenicità ed espressi ad alti livelli nei batteri menzionati, in vista di una estensione dei test al rilevamento di DNA retrotrascritto su stampo di mRNA al fine di rilevare solo il numero di cellule vitali. Il DNA batterico è stato estratto direttamente da campione mediante un metodo tratto dalla letteratura (1) opportunamente adattato ai tipi di campione considerati. Per l’estrazione di DNA da colture di arricchimento sono state utilizzate procedure standard. In questo lavoro è stato adottato un programma di PCR comune per tutti i patogeni presi in esame al fine di permetterne il rilevamento contemporaneo (35 cicli termici 94°C per 1 min, 58°C per 1 min, 72°C per 1 min preceduti da una denaturazione di 1 min a 94°C e seguiti da una estensione di 3 min a 72°C). Per il rilevamento in fluorescenza è stato usato l’intercalante SYBR Green. RISULTATI. Fig. 5. Curva di dissociazione termica da amplificazioni dirette eseguite su campioni inoculati con il ceppo S. sonnei LMG Fig. 6. Correlazione numero di cellule/Ct per amplificazioni eseguite su campioni inoculati con il ceppo S. sonnei LMG Listeria monocytogenes Il metodo ufficiale di rilevamento utilizzato è descritto dalla norma ISO :1996 (2). Il gene actA , scelto come target, codifica per la proteina extracellulare P60 coinvolta nella patogenicità. I primer usati sono lm-F e lm-R. La Fig. 1 riporta un’analisi eseguita su 14 campioni di formaggio con microflora complessa e dimostra la specificità del test messo a punto. Il limite di rilevamento è stato di 103 e 104 UFC/25 g direttamente da campione e di 102 e 1 UFC/25 g dopo arricchimento di 5 ore per soppressa e formaggio, rispettivamente. La Fig. 2 riporta la regressione numero di cellule/ciclo soglia per formaggio contaminato artificialmente, che permette una quantificazione accurata tra 102 e 106 UFC/25 g. Fig. 1. Curva di dissociazione termica per il test di Real-Time PCR eseguito su campioni prelevati in azienda dopo arricchimento. Fig. 2. Intervallo di linearità per il test di Real-Time PCR eseguito sul ceppo L. monocytogenes LMG inoculato artificialmente in campioni di formaggio. Staphylococcus aureus La frequenza di isolamento di questa specie nei prodotti di origine animale è molto elevata (4). La carica massima ammissibile è dell’ordine di 103 UFC/g per i formaggi e 102 UFC/g per i salumi. Viene isolato e identificato con i metodi prescritti dalla norma ISO 6888. I primer per questa specie, s.au-F e s.au-R, sono stati disegnati sul gene della termonucleasi nuc. I limiti di rilevamento raggiunti sono di 102 cellule nella reazione di PCR, sia da campione che da coltura (4) e 1 UFC/25 g da formaggio e 10 UFC/25 g da soppressa dopo 5 ore di arricchimento. Nelle Fig. 7 e 8 sono riportate rispettivamente le curve di dissociazione termica relative ad amplificazioni da campioni di formaggio (F, S) e cagliata (C) e la retta di calibrazione ciclo soglia/numero di cellule per grammo di formaggio. Fig. 7. Curve di dissociazione relative ad amplificazioni specifiche per S. aureus in campioni caseari prelevati in azienda. Fig. 8. Retta di calibrazione relativa ad amplificazioni da formaggi inoculati con S. aureus LMG 8224. Salmonella spp. Il rilevamento di questa specie con metodi colturali ha seguito la norma ISO 6579. Il gene scelto come target per la Real-Time PCR è ompC, codificante per una porina associata alla membrana esterna. I primer disegnati sono sal-F e sal-R’. I limiti di rilevamento del test messo a punto in questo lavoro sono stati di 104 UFC/25 g per il rilevamento diretto da entrambi i tipi di campione e di 1 UFC/25 g dopo arricchimento di 5 ore per entrambe le matrici analizzate. Nelle Fig. 3 e 4 sono visualizzate la curva di dissociazione termica relativa allo stesso numero di cellule in due tipi di campione, e la retta di riferimento per la quantificazione in formaggio. Yersinia enterocolitica Non esistono normative sui limiti di contaminazione ammissibili, pertanto la sua totale assenza viene assunta come criterio di accettabilità. Per il rilevamento con metodi colturali si segue la norma ISO Il test di Real-Time PCR con l’uso dei primer ail2-F e ail2-R è stato disegnato sul gene ail, codificante per una proteina di invasione. I limiti di rilevamento raggiunti sono stati 103 e 104 UFC su 25 g in formaggio e soppressa, rispettivamente. Dopo arricchimento di 5 ore è stato possibile rilevare 1 UFC/25 g per entrambi i tipi di campione. Le Fig. 9 e 10 riportano rispettivamente la curva di dissociazione termica relativa ad amplificazioni da colture di arricchimento e la retta di riferimento relativa al rilevamento in formaggio. Fig. 3. Curve di dissociazione termica da amplificazioni eseguite direttamente su due campioni inoculati con il ceppo S. enterica subsp. choleraesuis LMG Fig. 4. Intervallo di linearità per il test di Real-Time PCR eseguito su campioni di formaggio inoculati artificialmente con il ceppo S. enterica subsp. choleraesuis LMG Shighella spp. Non esistono metodi ufficiali per il rilevamento di questa specie a causa della scarsa sensibilità dei terreni selettivi. In Europa solo nella normativa britannica è riportato un protocollo di isolamento e identificazione (3). Il gene ipaH, scelto come target per la Real-Time PCR è situato sul plasmide di invasione. I primer disegnati sono shi.ipa-F e shi.ipa-R’. Le Fig. 5 e 6 mostrano le curve di dissociazione termica e la retta di quantificazione ottenuti con il metodo di PCR messo a punto. E’ stato possibile rilevare 104 UFC/25 g con e 102 UFC/25 g senza arricchimento. Fig. 9. Curve di dissociazione termica da amplificazioni relative a colture di arricchimento da campioni inoculati con Y. enterocolitica LMG Fig. 10. Curve di dissociazione termica da amplificazioni relative a colture di arricchimento da campioni inoculati con Y. enterocolitica LMG CONCLUSIONI. I procedimenti descritti possono avere interesse per protocolli di autocontrollo in fasi intermedie della produzione alimentare come la selezione delle materie prime e la scelta dei trattamenti di risanamento. Per migliorarne la sensibilità, nel rispetto della normativa sui limiti di contaminazione ammissibili, che richiede una sensibilità dieci volte superiore a quella fin qui raggiunta, si procederà ad analizzare maggiori quantità di campione e ad aumentare la resa di estrazione degli acidi nucleici. A tale scopo si valuteranno metodi già descritti per una efficiente separazione delle cellule batteriche da campioni alimentari (5). BIBLIOGRAFIA. 1. Drake et al. (1996) J. Food Prot. 59, 1031; Anon. (2005). 2. Off. J. Eur. Union. L338, , pp. 1-23; Health Protection Agency (2007); 3. National Standard Method BSOP ID 20 Issue 2; 4. Poli et al. (2007). Lett. Appl. Microbiol. 45, 529; 5. Wolffs et al. (2004). J. Clin. Microbiol. 42, 1042. RINGRAZIAMENTI. Questa ricerca è stata condotta grazie al supporto finanziario della Fondazione Cariverona. V Convegno AISSA “RELAZIONE SUOLO, PIANTA, ATMOSFERA: SICUREZZA E QUALITÀ DELLE PRODUZIONI AGROALIMENTARI E TUTELA DELL’AMBIENTE”, Foggia, dicembre 2007