Il ciclo cellulare Rudolf Virchow ( ) Dottrina cellulare:

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1 Il ciclo cellulare Rudolf Virchow (1821-1902) Dottrina cellulare:
«Quando una cellula esiste, ci dev’essere stata una cellula preesistente, proprio come un animale si origina solo da un animale e una pianta si origina solo da una pianta» 1858 Rudolf Virchow ( )

2 Sommario Il ciclo cellulare
Approcci sperimentali usati per lo studio del ciclo cellulare Regolazione del ciclo cellulare Mitosi Meiosi

3 Perché è importante studiare il ciclo cellulare?

4 Introduzione Il ciclo cellulare, o ciclo di divisione cellulare (CDC), è la serie di eventi che avvengono in una cellula tra una divisione cellulare e quella successiva. E’ un processo geneticamente controllato, costituito da una serie di eventi coordinati e dipendenti tra loro, dai quali dipende la corretta proliferazione delle cellule. Gli eventi molecolari che controllano il ciclo cellulare sono ordinati e direzionali: ogni processo è la diretta conseguenza dell'evento precedente ed è la causa di quello successivo.

5 Introduzione Due eventi principali:
S-phase (duplicazione del materiale genetico) M-phase (mitosi e citochinesi) M-phase

6 Introduzione

7 G0 Introduzione 6-8h 2-4h < 12h 1h
Durata delle fasi del ciclo cellulare - G1: variabile - S: 6-8 ore - G2: 2-4 ore - M: 1 ora Fase G2 •2° Gap •Si trova tra fase S e Mitosi •Le cellule si predispongono per la divisione mitotica –Produzione proteine specifiche (fuso mitotico, citodieresi) –Controllo del DNA replicato al fine di correggere eventuali errori •Duplicazione del centrosoma (tarda S- inizio G2) G0 Fase G1 •1° Gap (Intervallo) –Tra Mitosi e la fase di replicazione del DNA (Fase S) •La fase più lunga del ciclo –Altamente variabile a seconda del tipo cellulare •Periodo di crescita cellulare (la cellula riacquista le sue dimensioni normali) –Sintesi di RNA e proteine –Preparazione per la duplicazione del DNA Fase S •S = Sintesi •Durante la fase S avviene la Replicazione del DNA –Tutte le proteine che servono a tale scopo vengono sintetizzate durante la fase G1 •Durante la fase S avviene anche la sintesi degli istoni e altre proteine della cromatina

8 Introduzione La durata del ciclo cellulare varia col variare della specie, del tipo di cellula e delle condizioni di crescita

9 Come si studia il ciclo cellulare
Cell-Cycle Control Is Similar in All Eukaryotes Cell-Cycle Progression Can Be Studied in Various Ways Per identificare i fattori che controllano l’entrata delle cellule nelle fasi S e M del ciclo cellulare sono stati necessari esperimenti genetici e biochimici

10 Organismi modello per lo studio del ciclo cellulare
Organismi per lo studio del ciclo cellulare Cellule in coltura Il lievito: Saccharomyces cerevisiae che si divide per gemmazione Schizosaccharomyces pombe che si divide per scissione Xenopus laevis D. melanogaster Caenorhabditis elegans

11 Analisi genetica del ciclo cellulare
S. cerevisiae S. pombe Sistema sperimentale basato sull’uso di eucarioti semplici come i lieviti che sono funghi unicellulari

12 Analisi genetica utilizzata per identificare mutanti temperatura-sensibili del ciclo cellulare nei lieviti Mutanti cdc Alla temperatura permissiva il prodotto dei geni cdc viene sintetizzato Alla temperatura non permissiva (o restrittiva) il gene non viene espresso

13 Analisi genetica utilizzata per identificare mutanti temperatura-sensibili del ciclo cellulare nei lieviti

14 Studi genetici in C. elegans hanno chiarito i meccanismi che regolano l’ apoptosi.
John Sulston Sydney Brenner Robert Horwitz ƒDelle 1090 cellule somatiche generate durante lo sviluppo di C. elegans, 131 vanno incontro ad apoptosi. Mutazioni specifiche hanno portato all’identificazione dei geni coinvolti nella regolazione dell’apoptosi

15 Studi biochimici su ovociti, uova ed embrioni precoci
Per gli studi biochimici sul ciclo cellulare sono particolarmente adatti uova ed embrioni precoci di anfibi ed invertebrati marini. In questi organismi numerosi cicli cellulari sincroni fanno seguito alla fecondazione di uova di grandi dimensioni. Un uovo maturo di Xenopus, pronto per essere fecondato Isolando un gran numero di uova dalle femmine e facendole contemporaneamente fecondare mediante l’aggiunta di spermatozoi (o trattandole in modo da simulare la fecondazione), è possibile ottenere gli estratti necessari per l’analisi delle proteine e delle attività enzimatiche che regolano il ciclo cellulare

16 Studio della proliferazione cellulare
Visualizzazione di cellule in fase S 1_dopo somministrazione dell’analogo artificiale della timidina bromo-deossiuridina (BrdU) mediante colorazione con anticorpi anti-BrdU

17 Studio della proliferazione cellulare
Visualizzazione di cellule in fase S 2_mediante autoradiografia dopo somministrazione di 3H-timidina

18 Studio della proliferazione cellulare
Citofluorimetria a flusso Le cellule di una popolazione eterogenea vengono marcate con una o più molecole fluorescenti ed immesse in una camera di flusso dove vengono separate le une dalla altre. Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore. Viene quindi processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale e inviato all’analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico.

19 Studio della proliferazione cellulare
Hela cells Asynchronous Thymidine Nocodazole Cells have duplicated DNA but are blocked at mitosis (nocodazole inhibits microtubule polymerization).  A thymidine treatment block cells at the G1 to S-phase transition (thymidine treatment inhibits DNA synthesis)

20 THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM
The Cell-Cycle Control System Triggers the Major Events of the Cell Cycle

21 The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin-Dependent Protein Kinases (Cdks) La fosforilazione di proteine controlla la progressione attraverso il ciclo cellulare Le cicline sono state identificate sia in cellule di lievito che in cellule di mammifero. La loro concentrazione aumenta sino ad un livello massimo e poi segue una rapida degradazione. L’attività delle CdK è regolata dalla concentrazione delle cicline. Esistono vari tipi di cicline e vari tipi di Cdk

22 The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin-Dependent Protein Kinases (Cdks) Le Cdk attivate dalle cicline sono delle proteine serina-treonina chinasi. Fosforilano substrati coinvolti nelle varie fasi del ciclo, ad esempio nel passaggio tra G1 ed S, fosforilano gli istoni e permettono la compattazione dei cromosomi. Oppure fosforilano la lamina nucleare, disassemblandola e rompendo l’involucro nucleare. Altre proteine fosforilate sono quelle del citoscheletro, che servono al macchinario della divisione.

23 The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin-Dependent Protein Kinases (Cdks)

24 The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin-Dependent Protein Kinases (Cdks)

25 Le varie cicline nelle cellule di mammifero
The Cell-Cycle Control System Depends on Cyclically Activated Cyclin-Dependent Protein Kinases (Cdks) Le varie cicline nelle cellule di mammifero

26 Basi strutturali per l’attivazione delle Cdk
Aumento dell’affinità di legame ai substrati Spostamento dell’ansa a T Il sito attivo della Cdk è bloccato da una regione della proteina (ansa a T)

27 La regolazione dell’attivtà delle Cdk da parte di fosforilazione inibitrice
(2 fosforilazioni)

28 Inibizione del complesso ciclina-Cdk pa parte di una CKIs (Cdk Inhibitor Proteins)

29 Cell cycle regulators SUMMARY
CAK Cyclin kinase Cyclin-CdK Cyclin-CdK Cyclin-CdK P-ase Cdk CKIs (p27) Cyclin-CdK

30 Cell cycle regulators in cancer
CAK Cyclin Wee1 Cyclin-CdK Cyclin-CdK Cyclin-CdK Cdc25 Cdk CKIs (p27) Cyclin-CdK Alterations of genes encoding cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors p15INK4B (CDKN2B) and p16INK4A (CDKN2A) Alterations of cyclin D1 (CCND1), CCND2, CCND3, CDK4 and CDK6 genes.

31 THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM

32 Controllo della proteolisi da parte SCF
CKI viene fosforilata CKI-p è riconosciuto da SCF che è costitutivamente attivo CKI-p viene poli-ubiquitinata da SCF CKI-p-poliUb è degradata

33 Controllo della proteolisi da parte APC/C

34 SCF e APC/C target CKI G1, G1/S cyclin M- cyclin

35 THE CELL-CYCLE CONTROL SYSTEM
Arresto del ciclo cellulare Crescita cellulare   Proliferazione

36 DNA Damage Blocks Cell Division: The DNA Damage Response

37 Other stimuli activating the p53 pathway

38 Other stimuli activating the p53 pathway

39 The p53 signaling pathway is altered in the majority of human cancers.
The TP53 gene is deleted or mutated in approximately 55% of human cancers while its signaling is disrupted by alterations to its many regulators (listed to the right) and/or targets (not listed) in the remaining tumors.

40 The hallmarks of cancer

41 The p53 signaling pathway is altered in the majority of human cancers.

42 Abnormal Proliferation Signals Cause Cell-Cycle Arrest or Apoptosis, Except in Cancer Cells

43 Cell Proliferation is Accompanied by Cell Growth