Mutazioni Metodiche per la evidenziazione di mutazioni

Presentazione sul tema: "Mutazioni Metodiche per la evidenziazione di mutazioni"— Transcript della presentazione:

1 Mutazioni Metodiche per la evidenziazione di mutazioni

2 Mutazioni Delezioni Inserzioni Mutazioni puntiformi
Perdita di sequenze di DNA, di qualunque lunghezza anche un cromosoma intero Inserzioni Introduzione di ulteriori basi nella sequenza, in genere sequenze più corte delle delezioni e in conseguenza di duplicazione di sequenze pre-esistenti Mutazioni puntiformi

3 Mutazioni che modificano le sequenze codificanti
Mutazioni missense Nonsense Frame-shift. Slittamento della cornice di lettura Mutazioni silenti

4 Mutazioni missense Determinano la sostituzione di un aminoacido con un altro

5 Nonsense Produce un codone di stop determinando la terminazione prematura della sintesi proteica (prodotto troncato)

6 Frame shift Inserzione o delezione di un numero di nucleotidi diverso da tre o multipli. La sequenza di aminoacidi cambia.

7 Mutazione silente La mutazione non comporta una sostituzione di aminoacidi ne la abrogazione di un codone di terminazione

8 Mutazioni che non colpiscono le sequenze codificanti
Possono avere conseguenze anche molto gravi !

9 Mutazioni nelle sequenze di controllo
Influenzano il funzionamento del gene: modifica del promotore, del sito di legame da parte di un fattore di trascrizione, sito di splicing, segnale di poliadenilazione Mutazioni che influenzano la stabilità di mRNA

10 Metodiche per la evidenziazione di mutazioni
Sequenziamento RFLP SSCP DGGE NIRCA Protein truncation test Genotipizzazione mediante PCR

11 Sequenziamento DNA Tecnica definitiva - tutte le metodiche richiedono di essere confermate mediante s. Time consuming per grossi frammenti o per numerosi campioni Non economica Necessita di materiale di elevata qualità

12 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

13 Fragments detected by Southern blotting
cut DNA by restriction enzyme digestion hybridize labeled probe to DNA fragments labeled probe will detect one restriction fragment as shown This slide shows how a 32P-labeled probe (DNA or RNA) can detect a single restriction fragment. If the probe is complementary to an internal region in a restriction fragment, only one band will appear following Southern blot hybridization. The probe does not detect the adjacent upstream fragment (or any other fragment in the genome). 32P labeled hybridization probe restriction fragment detected by hybridization probe adjacent fragment not detected

14 RFLP Restriction fragment lenght polymorphism
Campione in esame e di controllo sono digeriti con enzimi di restrizione DNA digerito è corso su un gel e trasferito su membrana (Southern blotting) Filtro è probato con una sonda che riporta la sequenza di interesse Differenze nel size delle bande tra campioni indica la presenza di polimorfismo Costo modesto: il filtro può essere riusato con sonde differenti. Bassa sensibilità. Richiede elevata quantità di DNA

15 Southern blotting procedure
human genomic DNA (isolated from many cells) - gel electrophoresis of the DNA fragments gel will separate DNAs according to size restriction enzyme digestion millions of DNA fragments + hybridize membrane with a 32P-labeled DNA probe probe will base pair with the complementary DNA strands denature DNA into single- strands transfer DNA fragments to nitrocellulose membrane expose membrane to X-ray film develop film to visualize DNA band

16 Southern blotting analysis to detect mutated DNA
32P labeled probe A complete deletion Nel campione B la regione in celeste è interessata da una delezione che la abolisce completamente. Nel campione C la regione in celeste è interessata solo parzialmente da una delezione. B C partial deletion

17 Resolution of restriction fragments for the partial deletion

18 Southern blotting analysis
A. Normal DNA B. Complete deletion C. Partial deletion A B C left right right center

19 Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)
polymorphism that can be detected as a change in the restriction fragment length pattern -- alleles are defined by the sizes of bands obtained by Southern blot analysis Two alleles ‘A’ and ‘a’ that differ from one another by the absence or presence of a restriction enzyme cut site in the chromosome RFLPs are polymorphisms that are defined as changes (hence polymorphisms) in the nucleotide sequence that affect the sizes of restriction fragments (hence restriction fragment lengths). They are detected by Southern blotting. This figure shows how a single base-pair substitution can create a new restriction enzyme cut site. In this case, a G to A change creates a new EcoRI site and therefore changes the length of the EcoRI fragment show in this figure (it makes two fragments from one). The next series of slides (slides 14-18) shows how these restriction fragment lengths can be detected. EcoRI EcoRI A GAGTTC EcoRI EcoRI EcoRI a GAATTC

20 Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)
polymorphism that can be detected as a change in the restriction fragment length pattern -- alleles are defined by the sizes of bands obtained by Southern blot analysis polymorphism due to the absence or presence of a single cut site: “A” and “a” are alleles RFLP probe AA Aa aa Mapping genes is relatively quick and easy using RFLPs. As stated in the slide, RFLPs are polymorphisms that are detected by restriction enzyme digestion and Southern blotting. As can be seen in the figure, chromosomes 'A' and 'a' differ by only one base-pair at the site shown by large blue arrow. The single base-pair difference eliminates (A) or creates (a) a restriction enzyme cut site (shown by the downward black arrow). A probe (shown in red - this probe can be any DNA fragment chosen at random) specific to a region of the chromosome adjacent to a polymorphic restriction site will, therefore, detect different sized restriction fragments (flanked by the downward arrows) on the two different chromosomes. The probe will detect a larger restriction fragment on chromosome 'A' and a smaller fragment on chromosome 'a'. The sizes of the fragments are determined by gel electrophoresis followed by Southern blotting and hybridization with the 32P-labeled probe, as shown in the lower right. A person homozygous for 'A' (AA) will have only the larger fragment, as detected by the hybridization analysis. A heterozygote (Aa) will have both fragments, and a person homozygous for 'a' (aa) will have only the smaller fragment. It is possible, therefore, using this technique, to distinguish the two chromosomes (maternal and paternal) and ultimately to find an RFLP probe that identifies the chromosome carrying the abnormal gene. 32P A a polymorphic site caused by the creation / elimination of a restriction enzyme cut site polymorphism detected by Southern hybridization with a 32P- labeled probe

21 Tre tipi di mutazioni differenti che occorrono all’interno del frammento R-R e nella slide successiva……

22 puntiforme delezione inserzione
Differenze nel pattern di migrazione del frammento R-R inserzione

23 Confronta tra loro le due lane per ogni enzima

24 Omozigote S - Omozigote W - Eterozigote SW

25 Diagnosi prenatale di emofilia effettuata mediante PCR
Nel gene mutato viene perso il sito di BclI per cui l’azione dell’enzima di restrizione non produce due frammenti (99 e 43 bp) ma rimane il frammento integro (142 bp). Gene del fattore VIII polimorfismo per Bcl I 1 2 3 4 5 I II I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 (-) (+) presenza del sito Bcl I

26 1. Nota la sequenza fiancheg- I
Ibridazione con oligonucleotidi sequenza specifici ( ASO). (A) Oligonucleotide normale CACCAAAAGATGATATTTTC (B) Oligonucleotide mutante CACCAAA TGATATTTTC 2 1 1. Nota la sequenza fiancheg- giante la mutazione si amplifica per PCR un fram mento che lo contenga da individui sospetti I II 2. Si trasferiscono i prodotti di amplificazione mediante slot blotting distribuendolo in diversi slots 1 2 3 4 normale portatore A 3. Si ibridano le reazioni con ASO specifici per la sequenza normale e mutata B I-1 II-1 II-2 II-3 II-4 I-2 controllo

27 DNA fingerprinting Un importante campo di applicazione è rappresentato dall’amplificazione di siti ipervariabili del genoma umano, dove esistono numerose regioni polimorfiche, incluse molte sequenze ripetute in tandem, il cui esatto numero di ripetizioni differisce da individuo a individuo (a parte i gemelli monozigoti). Queste sequenze possono essere sfruttate per una tipizzazione fine in molti modi. Il più semplice e diffuso deriva dalla generazione di RFLP (restriction fragment lenght poliformism) che si ottengono digerendo genomi diversi con uno o più enzimi di restrizione, spesso associati all’utilizzo di sonde marcate. I profili di restrizione che si ottengono variano da individuo a individuo e sono noti come DNA fingerprints. Una variante importante di questa tecnica utilizza la PCR per amplificare sequenze a ripetizione variabile (VNTR) utilizzando primers fiancheggianti. Anche in questo caso da queste si può ottenere una mappa individuale (fingerprinting) utilizzata in svariate applicazioni forensi e medico legali. Una ulteriore variante all’utilizzo della PCR per amplificare VNTR consiste nella cosidetta RAPD-PCR ( random amplified polimorphic DNA) che si basa sull’utilizzo di primers casuali a bassa omologia. Anche in questo caso si ottengono profili di amplificazioni caratteristici da individuo a individuo.

28 Applicazioni forensi Negli eucarioti superiori i geni rappresentano solo una piccola parte del genoma, che è prevalentemente costituito da DNA intergenico. Tra quetso una parte importante è costituita da elementi ripetuti disposti in tandem detti satelliti Tipo di ripetizione Ripetizione per locus Numero di loci Lunghezza ripetizione Satellite 1-2 per cromosoma Minisatellite 10-103 Migliaia per genoma 9-100 Microsatellite 10-102 Fino a 105 per genoma 1-6 La distribuizione casuale e l’estrema variabilità di sequenze in tandem VNTR (variable number tandem repeat) le rendono molto utili per le tipizzazioni genetiche,

29 Repeat expansion trinucleotide repeats
VNTRs (variable number of tandem repeats) CAG CAG CAG CAG PCR product CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG

30 polymorphism due to variable number of tandem repeats (VNTR):
RFLP probe ‘A’, ‘B’, and ‘C’ are alleles 32P AA AB BC A B C RFLPs can also be caused by variable number of tandem repeats (VNTRs). These are short repeated sequences, often referred to as microsatellites, that can be found as being comprised of different numbers of individual repeat units. Chromosome 'A' is shown to have four such repeat units (horizontal arrowheads), whereas chromosome 'B' has three such repeats, and chromosome 'C' has two. Rather than creating or eliminating a restriction enzyme cut site, these VNTRs change the sizes of the DNA fragments between restriction enzyme sites. Oftentimes, because these repeats can expand or contract in numbers, there can be multiple alleles detected by a single RFLP probe. This is in contrast to the point polymorphism shown previously that by definition can only have two alleles. It is highly advantageous to have highly polymorphic sites with multiple alleles, as they are more likely to be polymorphic within a family and therefore be useful for mapping genes. polymorphism detected by Southern hybridization with a 32P- labeled probe polymorphism caused by deletion / insertion between restriction enzyme cut sites VNTRs are useful because they are frequently highly polymorphic-- there are more than two alleles, i.e., A,B,C,D,E… highly polymorphic sites are more useful for distinguishing chromosomes in the population because there are more heterozygous chromosomes

31 Inheritance of a hypervariable polymorphism
This slide shows a hypervariable VNTR polymorphism in a family pedigree. Everyone in the family has two distinguishable alleles (i.e., no one is homozygous at the VNTR locus). Patterns such as this help in identifying the two chromosomes and make it easier to track the inheritance of a genetic disease. Southern blot using a probe for a hypervariable VNTR Everyone in the pedigree is heterozygous at the locus From Thompson & Thompson, “Genetics in Medicine”

32 regione a lunghezza ipervariabile (VNTR)
individuo A individuo B VNTR 1 cromosomi omologhi VNTR 2 A B

33 Nel tipico esempio accanto permette di risolvere
I VNTR sono molto utili nei test di paternità e nelle cause giudiziarie, perché permettono di comparare velocemente campioni di DNA anche in assenza di informazioni sulle sequenze Nelle prime applicazioni sonde VNTR multiple venivano ibridate in esperimenti Southern a dare dei profili di DNA (DNA fingerprinting) sostanzialmente unici da individuo a individuo. Questa applicazione richiede abbondante materiale di partenza ed è attualmente usato prevalentemente nelle analisi di paternità. Nel tipico esempio accanto permette di risolvere facilmente un caso di paternità dubbia

34 L’utilizzo di sonde multilocus da pattern complessi rende più facile escludere un caso dubbio, ma più difficile provarlo. L’uso di sonde VNTR monolocus da risultati più certi. Inoltre la possibilità di amplificazione con PCR rende queste tecniche rapide e veloci. Variabilità di un singolo VNTR tra individui

35 Esempi di Fingerprinting di DNA
utilizzato in un casi di stupro

36 SSCP Single stranded conformational polymorphism Anche quando non è nota la natura esatta della mutazione, è possibile individuare alleli mutanti anche di un solo nucleotide con la SSCP Accoppiamento di basi all’interno della stessa catena determina la formazione di strutture secondarie complesse in molecole monocatenarie Mutazioni modificano la formazione di queste strutture e la loro mobilità in gel non denaturanti Frammenti <400 bp dsDNA sono denaturati e messi a migrare in gel non denaturanti Per evidenziare il maggior numero di mutazioni i campioni devono essere fatti migrare insieme ai controlli in differenti condizioni: temperatura, tampone, +/- glicerolo

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38 La mutazione al punto rosso fa perdere appaiamento intracatenario

39 DGGE Gel Elettroforesi su gradiente denaturante
Segmenti amplificati di dsDNA <500 bp sono sottoposti a elettroforesi attraverso un gradiente di urea e formamide La mobilità si modifica al dissociarsi delle catene complementari Il punto di dissociazione è determinato dalla sequenza ed è modificato da mutazioni

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49 Non-isotopic RNase cleavage assay (NIRCA)
La regione di interesse è amplificata con primers che incorporano promotore fagico I frammenti sono trascritti e sono ibridizzati insieme. Gli eterozigoti formeranno complessi eteroduplex. Trattamento con RNAse cliva le regioni che contengono mismatch tra le catene Prodotto della reazione è sottoposto a Elettroforesi su gel Taglio di eteroduplex altera il bandeggio dei frammenti

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56 3 bande 1 banda

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58 Protein truncation test
PCR o RT-PCR con 5’ primer che include sequenza Kozak del promotore fagico e ATG Il prodotto è sottoposto a Reazione accoppiata di trascrizione e traduzione Mutanti troncati producono proteine dalle bande più piccole su gel di SDS-PAGE

59 Metodi di Genotipizzazione mediante PCR
I metodi precedentemente descritti non sono di solito usati nella ricerca di routine per polimorfismi noti. Maggior parte di metodi adottano un qualche tipo di PCR: PCR e digestione enzimatica PCR allele-specifica PCR e ibridizzazione allele specifica

60 PCR e digestione enzimatica
Si applica ogniqualvolta una mutazione genera oppure elimina un sito di restrizione Si amplifica la regione di interesse che contiene il sito eventualmente mutato Il prodotto PCR è digerito con l’enzima informativo e analizzato su gel

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66 1 2 Detection of Lesch-Nyhan deletions by multiplex PCR
exons in the HGPRT (HPRT) gene PCR products resulting from the use of multiplex primers -- each product is flanked by its own set of leftward and rightward primers for example, for exons 1 and 2: 1 2 PCR products

67 Detection of Lesch-Nyhan deletions by Multiplex PCR
1 2 3 4 5 1) deletion of exon 2 2) total gene deletion 3) deletion of exons 6-9 4) deletion of exon 9 5) normal

68 PCR e ibridizzazione allele-specifica
La regione contenente il sito polimorfico è amplificata per un frammento di bp I prodotti amplificati sono blottati su filtri in replica: dot-slot Ciascun filtro è ibridizzato con oligo allele-specifico

69 1 campione diverso x slot. 2 filtri uguali. Probe differente.