Ricerca e sviluppo nei processi industriali

Presentazione sul tema: "Ricerca e sviluppo nei processi industriali"— Transcript della presentazione:

1 Ricerca e sviluppo nei processi industriali
Screening di biocatalizzatori con migliori proprietà Miglioramento dei ceppi industriali Ottimizzazione della composizione dei terreni di coltura Miglioramento delle procedure di recupero del prodotto Massimizzazione delle rese di produzione!

2 Miglioramento dei ceppi industriali
Il ceppo, risultato di una selezione per la capacità di produrre il prodotto, è immediatamente oggetto di uno studio di fattibilità per il suo miglioramento versatilità utilizzo di substrati produzione sottoprodotti resistenza a stress durante il processo produttivo vitalità (ricircolo della biomassa) parametri fisiologici (µ, richiesta di O2, temperatura ottimale ecc.) OBIETTIVO: ridurre ulteriormente i costi di produzione SENZA aumentare il capitale investito Tecniche di ingegneria cellulare e/o metabolica per esaltare alcune proprietà del ceppo o per introdurre nuove funzioni

3 Alterare i controlli di regolazione.
Miglioramento dei ceppi industriali Gli strumenti impiegabili per il miglioramento sono legati a quante e quali informazioni possediamo sul microrganismo e sul processo. Tecniche di mutagenesi random Ricombinazione (naturale o indotta) del materiale genetico Metodi ricombinanti Metodi –omici informazioni Alterare i controlli di regolazione. Eliminare i “colli di bottiglia” (reazioni lente).

4 Metodi di mutagenesi non ricombinanti
Metodi che agiscono sul DNA in assenza di replicazione

5 Analisi del fenotipo dei mutanti
Un buon schema di mutagenesi deve ottimizzare alcuni parametri al ceppo Tasso di sopravvivenza, % di individui che sopravvivono alla mutagenesi (< 1%) Frequenza di mutazione, n. di mutanti/n. di sopravviventi (massima possibile) Numero di mutazioni introdotte Aploide mononucleato Batteri in crescita esponenziale Mutazione a carico di ribosomi Mutazione a carico di proteine di membrana Per osservare il fenotipo associato a mutazioni recessive (quelle più spesso ricercate) è necessario attendere il “ritardo fenotipico”. La giustificazione molecolare è schematizzata a lato

6 La mutagenesi random può non dare i risultati attesi perché:
frequenza di mutazione non omogenea lungo tutto il genoma scarsa efficienza dei sistemi di riparo (tossicità elevata del mutageno) ulteriori mutazioni a soppressione soppressori intragenici (nello stesso gene in cui è avvenuta la mutazione primaria) soppressori extragenici (i più frequenti generano t-RNA mutati)

7 Metodi basati sulla ricombinazione per ottenere ceppi migliorati
Ricombinazione naturale es. starter di Lactococcus per l’industria casearia resistenti alle infezioni fagiche, ottenuti con l’impiego di plasmidi coniugativi Ricombinazione sessuale Fusione di protoplasti E’ utile per quei ceppi che mancano di un ciclo sessuale o parasessuale ben definito! Due tipologie cellulari diverse possono essere indotte a fondersi ed a rimescolare il loro patrimonio genetico. Prima produzione dei protoplasti mediante idrolisi del rivestimento cellulare, quindi fusione indotta da PEG, polietilen glicole Elettrofusione, mediante l’applicazione di campi elettrici pulsanti

8 Metodi ricombinanti Metodi -omici
Azione mirata su geni specifici coinvolti nel processo produttivo: Aumento del pool di precursori Rimozione di vie metaboliche competitive o non necessarie Inserimento, modifica o delezione di geni regolatori Alterazione/modifica regioni di regolazione trascrizionale Aumento del n. di copie di geni che codificano enzimi dei passaggi lenti Aumento della efficienza di secrezione del prodotto (per la produzione di antibiotici) Aumento della resistenza alla molecola Metodi -omici

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10 Corynebacterium glutamicum
Gram-positive, non-pathogenic, fast growing soil bacterium Pathways leading to amino acids are much simpler in their regulation when compared to E. coli: -- very few enzymes are feedback controlled -- good secretion -- genome sequenced Problems: 1) vector system are far from ideal (E.coli vectors will not work) 2) Transformation rates are low

11 La lisina fa parte di quel gruppo di amminoacidi che vengono sintetizzati a partire da ossalacetato; tali amminoacidi sono detti della famiglia dell’aspartato poiché condividono l’intermedio aspartato. L-lisina

12 La prima tappa della via metabolica prevede la fosforilazione dell’aspartato ad aspartilfosfato ad opera dell’aspartato chinasi riduzione ad aspartato semialdeide condensazione con una molecola di piruvato e la conseguente sintesi del diidropicolinato riduzione a tetraidropicolinato

13 La via biosintetica della lisina in C
La via biosintetica della lisina in C. glutamicum giunti al tetraidropicolinato si biforca: una direzione prevede una serie di quattro passaggi per giungere alla formazione del diamminopimelato (via della succinilasi), nell’altra si ha il passaggio diretto da tetraidrodipicolinato a diamminopimelato mediato dalla diamminopimelato deidrogenasi

14 Strain improvement C. glutamicum, come tutti i batteri produttori di amminoacidi, normalmente non produce grosse quantità di lisina quindi, per ottenere quantità di amminoacido compatibili con le richiesta dell’industria, sono state sviluppate, nel tempo, diverse procedure di miglioramento del ceppo microbico. il primo approccio utilizzato è stato quello di indurre delle mutazioni casuali (per mutagenesi chimica o per irradiazione UV) nel ceppo selvatico di C. glutamicum e di selezionare i mutanti iperproduttori di lisina. Una progettazione più razionale dei mutanti è iniziata negli anni ottanta quando i primi studi sui flussi metabolici hanno consentito una conoscenza più approfondita della via metabolica che conduce alla lisina

15 Con il termine Metabolic Flux Analysis (MFA) si intende il calcolo dei flussi intracellulari utilizzando un modello stechiometrico che descriva le reazioni intracellulari più rilevanti i bilanci di materia Dati il modello e le relazioni di bilancio, il calcolo dei flussi intracellulari si basa sulle misure sperimentali dei flussi extracellulari, ovvero sulle velocità (misurabili sperimentalmente) di consumo dei substrati e di secrezione dei prodotti Il risultato finale del calcolo dei flussi è una mappa metabolica in cui ad ogni reazione biochimica è associata una stima della velocità di reazione allo stato stazionario

16 Strain improvement I primi studi sui flussi metabolici ( basati sul bilancio di massa dei prodotti extracellulari) oltre a caratterizzare i principali nodi (punti di incontro di diverse vie metaboliche) della via metabolica dimostrarono che la resa di lisina dipendeva dal nodo fosfoenolpiruvato/piruvato e dalla resa di produzione dell’ossalacetato da parte dei pathways anaplerotici.

17 Strain improvement Il limite principale del metodo basato sul bilancio di massa dei prodotto extracellulari, che non tiene conto degli intermedi intracellulari, è che non consente di avere informazioni sulla reversibilità di certe reazioni poiché tiene conto solo del flusso netto tra substrato e prodotto. Questo metodo, inoltre, non consente di risolvere le singolarità strutturali di certe vie metaboliche nel caso della lisina ad esempio non consentiva di discriminare tra i due possibili meccanismi anaplerotici che conducono alla sintesi di ossalacetato: la via della piruvato carbossilasi e quella della fosfoenolpiruvato carbossilasi. ?

18 13C Metabolic Flux Analysis (MFA)
13C based flux balance model Use 13C-label to track the carbon flow Calculate the actual fluxes in metabolism. E EMP/PPP/ED pathway PEP Pyruvate Acetyl-CoA CIT ICT OXO SUC FUM OAA MAL Asp CO2 or Formate CO2 C1 pool Glycine Serine PGA Lactate Glu Glyoxylate SUC from OXO SUC from ICT Acetate 1 2 3 Hydroxypyruvate Glycerate 0.80 0.15 0.84 0.11 0.58 0.35 0.06 0.19 0.81 0.65 0.10 0.88 0.56 0.44 0.95 0.04 0.17 0.43 0.39 Formate 4 Phe (TCA cycle and anaplerotic reactions).

19 Strain improvement Per superare limiti dei primi studi sui flussi metabolici è stato necessario acquisire informazioni sui metaboliti intracellulari Questo tipo di studi sui flussi metabolici hanno confermato l’importanza dei pathways anaplerotici per la produzione di lisina e in particolare hanno stabilito che il rifornimento dell’ossalacetato si deve sostanzialmente alla piruvato carbossilasi (pyc), che rifornisce l’ossalacetato dalla carbossialzione del piruvato.

20 Strain improvement Con questo tipo di analisi dei flussi metabolici è stata analizzata la distribuzione degli intermedi tra le due vie per la biosintesi della lisina, quella della diamminopmelato deidrogenasi e quella della succinilasi. Tali studi hanno stabilito che via diretta rappresenta circa il 40% del flusso verso la formazione della lisina e che la scelta della via è funzione della fase di crescita. Infatti, mentre all’inizio della crescita circa il 75% della lisina è prodotto mediante la via della deidrogenasi, nella fase finale del processo di fermentazione, essa è prodotta quasi esclusivamente dalla via della succinilasi. Ciò è giustificato dal fatto che la deidrogenasi ha una debole affinità per uno dei suoi substrati ovvero l’ammonio, per cui, quando esso è presente in basse concentrazioni la deidrogenasi non può contribuire alla formazione della lisina, in queste condizioni è favorito il flusso nella via della succinilasi. Controllo della concentrazione di ammonio durante tutta la fermentazione

21 Strain improvement Sono stati quindi progettati dei mutanti per valutare l’effetto della sovraespressione di pyc sulla crescita cellulare e sulla produttività specifica di lisina in C. glutamicum. Sorprendentemente si è osservato che la sovraespressione del gene codificante la piruvato carbossilasi determina un sostanziale aumento di biomassa a cui non corrisponde alcun effetto positivo sulla produzione di lisina!!

22 Strain improvement L’assenza dell’attesa iperproduzione di lisina ha suggerito l’esistenza di altri potenziali “colli di bottiglia” nella via metabolica che minimizzano l’effetto della sovraespressione del gene pyc. Già dai primi studi sui flussi metabolici era emerso che la fosforilazione dell’aspartato rappresenta un punto nevralgico della sintesi della lisina ma la sovraespressione del gene ask aveva determinato solo una riduzione della crescita accompagnata da un minimo aumento della produttività specifica della lisina, questo risultato è dovuto alla mancanza di equilibrio tra l’aumentata attività aspartato chinasica, che devia il flusso metabolico verso la lisina, e l’attività nativa della piruvato carbossilasi che contribuisce al rifornimento di ossalacetato.

23 Strain improvement Quindi la creazione di un ceppo capace di sovra produrre contemporaneamente sia la piruvato carbossilasi che l’aspartato chinasi ha consentito di ottenere un aumento del 250% della produttività specifica di lisina, senza influenzare la velocità di crescita o la densità cellulare finale della coltura.

24 Strain improvement Il sequenziamento del genoma di C. glutamicum ha aperto la strada a nuovi approcci di ingegneria metabolica come ad esempio l’ingegneria metabolica inversa definita dagli autori “genome-based strain recostruction”.

25 Genome-based strain recostruction
Strain improvement Genome-based strain recostruction Con questo approccio sono state identificate tre mutazioni puntiformi associate da aumento di produttività del ceppo C. glutamicum: la prima è stata individuata nel gene codificante l’aspartato chinasi la seconda è a carico della piruvato carbossilasi la mutazione introdotta nell’enzima omoserina deidrogenasi, che compete con la diidropicolinato sintetasi per aspartato semialdeide, ne ha determinato una ridotta attività catalitica. Queste mutazioni introdotte per scambio allelico nel ceppo selvatico hanno avuto sulla produzione del ceppo ingegnerizzato non un effetto addizionale ma sinergico dando vita ad un batterio capace di produrre 80g/l di lisina in sole 27 ore.

26 Strain improvement…verso la system biology