Ceppi produttori: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum e lactofermentum, Microbacterium ammoniaphilum • gram+, auxotrofi per biotina • non.

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1 Ceppi produttori: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum e lactofermentum, Microbacterium ammoniaphilum • gram+, auxotrofi per biotina • non sporigeni, non mobili • usano zuccheri (molasse o idrolizzato d'amido) come fonte C e ammonio solfato come fonte N per la produzione Sintesi del glutammato: glutammato deidrogenasi o glutammato sintasi Caratteristiche dei produttori: 1. Bassa attività KGDH 2. Alta attività PEP carbossilasica 3. Esigenti in biotina come fattore di crescita I punti 1 e 2 sono ovvi se si considera la biosintesi del glutammato: • La bassa attività KGDH interrompe il TCA e permette la deviazione del flusso verso la sintesi del glutammato (Vmax GDH 150> Vmax KGDH) L’ attività PEPC permette il continuo rifornimento del TCA, che viene mantenuto funzionale dalla via anaplerotica del gliossilato.

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5 1. La biotina è necessaria a concentrazioni elevate per la crescita, mentre a concentrazioni intermedie la crescita è ridotta e la produzione di glutammato è massima 2. Gli acidi grassi supplementati favoriscono il processo di secrezione 3. Gli antibiotici beta-lattamici favoriscono la produzione ad alte concentrazioni di biotina 4. Ossigenazione sufficiente a garantire il metabolismo aerobio ed evitare accumulo di lattato o succinato

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7 La produzione di glutammato dipende quindi sia da una regolazione favorevole del metabolismo del TCA, ma anche ad un aumento di secrezione del prodotto in particolari condizioni colturali e di background genetico. Risultano però abbandonate le precedenti teorie di overflow e leakage di glutammato dovuto ad alterazioni della permeabilità della membrana. Ci sono invece indicazioni di un meccanismo di trasporto specifico del glutammato (secrezione o uptake invertito. Non ci sarebbe ACCUMULO intracellulare del prodotto che verrebbe attivamente secreto, impedendo una eventuale inibizione biosintetica feedback (PEPC è repressa da aspartato e glutammato).

8 Composizione del terreno:
• Fonte C: amido idrolizzato o molasse (solo se aggiungo penicillina o C saturi, in quanto c’è troppa biotina nelle molasse). La fonte C viene aggiunta in fed-batch • Fonte N: ammonio cloruro o solfato, urea. La fonte N è critica per la produzione. L’ammonio inibisce la crescita e va tenuto a concentrazioni basse e aggiunto in fed-batch. Inoltre l’assimilazione di ammoniaca da ammonio e la produzione di glutammico abbassano il pH e si ferma la crescita. Si può ovviare utilizzando ammoniaca gassosa mantenendo pH = 7-8, oppure con urea che da' ammoniaca e acqua per azione delle ureasi

9 product Main fermentation strain inoculum sugar Cell separation
seeding Pre-seeding sugar sterilization Cell separation evaporation crystallization drying product Scaling up Down stream Feeding biomass Mother liquors

10 Processo: • L'inoculo viene prodotto per scaling up • La fermentazione è aerobia, quindi l’ossigeno va fornito di continuo • Alla fine della fermentazione il terreno viene centrifugato, evaporato e il prodotto cristallizzato a temperatura e pH controllati • Le rese sono > 50% (g/g di glucosio) • Le produzioni sono > 150 g/L • Le produzioni totali sono tonnellate/anno (nel 1984) Miglioramento dei ceppi produttori: • Aumento della permeabilità al glutammato • Aumento dell'attività PEPC (fissaggio CO2) • Bassa attività PDH (aumento attività via anaplerotica dell'ossalacetato)