POLIMERASE CHAIN REACTION

Presentazione sul tema: "POLIMERASE CHAIN REACTION"— Transcript della presentazione:

1 POLIMERASE CHAIN REACTION
Amplificazione di specifici frammenti di DNA mediante l’uso di oligonucleotidi primer che definiscono la regione di interesse

2 LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)
1 COPIA 2 COPIE 4 COPIE 8 COPIE 16 COPIE 32 COPIE 64 COPIE

3 LOCALIZZAZIONE DEI PRIMER DELLA PCR

4 SCHEMA SEMPLIFICATO DI UN CICLO DI PCR

5 Esempio di tre cicli di PCR

6 THERMOCYCLER Apparecchio che consente modifiche veloci della temperatura in un blocco in cui vengono alloggiate le provette contenenti la miscela di reazione

7 TIPI DI THERMOCYCLER Refrigerazione/riscaldamento del blocco
Economico Lento Effetto Peltier Più rapido Più costoso

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9 Fattori che influenzano la resa della PCR
Specificità scelta dei primer, condizioni della reazione, contaminazioni Sensibilità eterogeneità genomica, presenza di inibitori, efficienza della reazione Riproducibilità standardizzazione di: preparazione del campione, protocollo di PCR, metodo di rivelazione

10 Curva di una reazione di PCR
“plateau” 0.1 pmoli di prodotto Fase esponenziale 0.01 10 20 30 Numero di cicli

11 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

12 Inattivazione termica della polimerasi
Temperatura (°C) Tempo (minuti) 92, 97, Tempo di mantenimento del 50% di attività della polimerasi

13 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

14 Concentrazione limitante della polimerasi
Con il procedere della reazione il numero di molecole di prodotto aumenta, mentre il numero di molecole di enzima libero inizia a diventare limitante Importante e la competizione per l’enzima da parte di prodotti non specifici Aumentare la specificità della reazione limita l’accumulo di prodotti aspecifici

15 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

16 Ridotta efficienza di denaturazione
Con il procedere della reazione si ha una riduzione della fase di denaturazione poiché all’aumentare della concentrazione del DNA stampo aumenta la temperatura di “melting” richiesta Usare temperature troppo basse o per tempi brevi non portano ad un aumento esponenziale del target

17 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

18 Innefficace “annealing” dei primer
Riduzione dell’efficienza della formazione del complesso primer-target “Annealing” aspecifico dei primer “Annealing” del prodotto

19 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

20 Attività esonucleasica della Taq-polimerasi
I substrati per l’attività esonucleasica 5’3’ possono essere: il prodotto di PCR qualsiasi prodotto contiene una struttura secondaria stabile

21 Fattori che determinano l’effetto “plateau”
Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

22 Competizione per i reagenti
Man mano che procede la reazione aumenta il prodotto e si riducono i reagenti verso i quali competono anche i prodotti aspecifici

23 Controllo di qualità in PCR
Controllo positivo per verificare la funzionalità di tutti i reagenti va scelto con attenzione (la più piccola diluizione in grado di dare un risultato positivo) Controlli negativi per evidenziare eventuali risultati falsi positivi

24 Metodi per la rivelazione dei
prodotti PCR

25 Metodi per la rivelazione dei prodotti PCR
Elettroforesi su gel Tecniche di ibridazione Sequenza HPLC Elettroforesi capillare

26 Principali metodi di separazione elettroforetica
Gel di agarosio PAGE elettroforesi su gel di poliacrilammide RFLP SSCP DGGE TGGE CCM

27 Gel di agarosio E’ un polimero lineare
La visualizzazione avviene grazie alla colorazione con etidio bromuro Tale colorante contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi del DNA dando origine ad un legame che aumenta la quantità di fluorescenza se confrontato con quello libero La distanza della banda rispetto al punto di deposizione sul gel è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento amplificato

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29 Gel Electrophoresis

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31 log m = log m0 - Krt La velocità di migrazione è inversamente proporzionale al log10 del numero di coppie di basi e dipende dalla concentrazione del gel. m = mobilità elettroforetica del DNA m0= mobilità elettroforetica libera del DNA t = concentrazione del gel Kr = Coefficiente di ritardo

32 Parametri che regolano la migrazione elettroforetica del DNA
Dimensione molecolare del DNA Concentrazione di agarosio Conformazione del DNA Intensità della corrente di voltaggio non superiore a 5 V/cm Composizione in basi

33 Range di separazione in un gel contenente differenti quantità di agarosio
nel gel (%w/v) delle molecole di DNA ( kb) 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2

34 Le tecniche elettroforetiche:
Permettono solo di valutare la lunghezza del prodotto PCR in base al confronto con bande di migrazione a lunghezza nota Esiste sempre la possibilità che bande di amplificazione non previste abbiano lunghezze simili a quella attesa Non sempre il prodotto di PCR è omogeneo visibile sul gel come una singola banda

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37 Amplification Fragment Length Polymorphisms Restriction digestion
(AmpFLPs) (1) Normal DNA (2) Mutant DNA PCR Product Restriction digestion analysis 1 2 3 SM

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40 ELETTROFORESI CAPILLARE
Gel in un capillare di metallo (diametro inf. a 1 mm) Migrazione veloce Capillare può essere riutilizzato

41 elettroforesi capillare
Schema di apparato per elettroforesi capillare

42 Funzionamento dell’elettroforesi
capillare Una piccola quantita di soluzione contenente il campione viene introdotta all’estremità anodica. Per la separazione viene applicato una differenza di potenziale tra le due estremità del capillare. Le molecole migrano con velocità differenti lungo il capillare verso l’elettrodo di carica negativa. Gli analiti sebbene siano separati in base alla velocità di migrazione elettroforetica, vengono spinti verso il catodo per il fenomeno dell’elettroosmosi.

43 Funzionamento dell’elettroforesi capillare
La velocità del flusso elettroosmotico è più elevata della velocità di migrazione degli analiti: tutti gli ioni, indipendentemente dalla carica si spostano verso il catodo. Le molecole con carica positiva raggiungono il catodo più velocemente (migrazione elettroforetica e flusso elettroosmotico si sommano). In vicinanza del catodo le molecole attraversano una finestra dove ne viene rivelato il passaggio attraverso varie tecniche.

44 PCR QUANTITATIVA Analisi della quantità di un acido nucleico presente in una soluzione Prodotto di reazione proporzionale alla quantità di substrato nella fase di amplificazione esponenziale

45 Quantizzazione di un acido nucleico mediante PCR
“plateau” 0.1 pmoli di prodotto Fase esponenziale 0.01 10 20 30 Numero di cicli

46 SISTEMA TAQMAN Basata su un oligo interno al prodotto di PCR marcato con due pigmenti fluorescenti Degradazione dell’oligo proporzionale al prodotto di amplificazione

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51 FASI DELLA REAZIONE TAQMAN

52 QUANTIZZAZIONE MEDIANTE TAQMAN

53 SISTEMA LIGHTCYCLER Basata su due oligo interni al prodotto di PCR marcati con due pigmenti fluorescenti Appaiamento degli oligo in tandem proporzionale al prodotto di amplificazione

54 APPARECCHIO LIGHTCYCLER

55 SISTEMA LIGHTCYCLER

56 SISTEMA LIGHTCYCLER

57 CURVE LIGHTCYCLER

58 ANALISI DI CURVE DI MELTING