CLONAGGIO DI UN FRAMMENTO GENOMICO NEL VETTORE pUC

Presentazione sul tema: "CLONAGGIO DI UN FRAMMENTO GENOMICO NEL VETTORE pUC"— Transcript della presentazione:

1 CLONAGGIO DI UN FRAMMENTO GENOMICO NEL VETTORE pUC

2 (induttore)

3 Agar agar: miscela di polisaccaridi estratta da alcuni tipi di
TRASFORMAZIONE di CELLULE COMPETENTI E PIASTRAMENTO SU PIASTRE DI AGAR E TERRENO CONTENTI AMPICILLINA E X-GAL Agar agar: miscela di polisaccaridi estratta da alcuni tipi di alghe rosse

4 CRESCITA OVER-NIGHT A 37°C

5 SINGOLI CLONI BATTERICI PRELEVATI E CRESCIUTI IN COLTURA LIQUIDA

6 MIDIPREP MAXIPREP MINIPREP Grandi preparazioni di plasmide da utilizzare per diversi scopi: sequenziamento espressione del prodotto genico trasfezioni in cellule eucariotiche Piccola preparazione di plasmide per verificare il clonaggio: migrazione elettroforetica PCR sequenziamento

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8 CENTRIFUGAZIONE E RACCOLTA DELLE CELLULE IN UN PELLET

9 LE CELLULE VENGONO RISOSPESE
NELLA SOLUZIONE I LEGGERMENTE IPOTONICA

10 SI AGGIUNGE SOLUZIONE II (LISI ALCALINA, pH = 12,0-12,5) CON NAOH E SDS

11 SI AGGIUNGE SOLUZIONE III CON K- ACETATO (NEUTRALIZZANTE pH = 7,0)
Il DNA genomico non si rinatura e si riaggrega in una massa aggrovigliata che forma insieme a proteine e membrane un aggregato biancastro facilmente separabile dalla fase liquida mediante centrifugazione.

12 Si preleva il spn e si aggiunge ad una miscela di egual volume di fenolo-cloroformio (1:1)
I solventi organici fanno precipitare le proteine all’interno del solvente e nell’interfaccia

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14 Si preleva la fase acquosa che contiene il DNA e vi si aggiunge alcol (etanolo o isopropanolo)
In presenza di cationi monovalenti (come Na+) il DNA precipita e viene recuperato dopo centrifugazione

15 Si risospende il pellet DNA con Tampone TE 1x (Tris-HCL + EDTA)
Caricamento di una piccola aliquota su gel di agarosio in cui è presente EtBr

16 Illuminando il gel con luce UV l’EtBr emetta fluorescenza rosa
Il colorante EtBr si intercala tra le basi adiacenti nella doppia elica del DNA Illuminando il gel con luce UV l’EtBr emetta fluorescenza rosa

17 Plasmide: DNA circolare
bp

18 circolare circolare linearizzato linearizzato superavvolto superavvolto