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2 Lezioni di biotecnologie
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3 Lezione 1 Il clonaggio 3 © Zanichelli editore, 2014 3 3

4 Il clonaggio non è la clonazione
4 Il clonaggio non è la clonazione Si definisce clonaggio un sistema per ottenere molte copie di un tratto di DNA inserendolo in un ospite mediante l’uso di vettori molecolari. La clonazione in biologia è invece la riproduzione agamica, naturale o artificiale, di individui o cellule con identico patrimonio genetico (cloni). Esempi di processi clonogenici naturali sono la scissione binaria dei batteri o la mitosi delle cellule eucariotiche. © Zanichelli editore, 2014 4

5 Le tappe del clonaggio Il clonaggio richiede:
5 Le tappe del clonaggio Il clonaggio richiede: l’isolamento di una particolare sequenza di DNA (non necessariamente codificante per una proteina) dall’insieme di tutte le sequenze del DNA di un organismo (genoma); l’inserimento della sequenza di DNA in una cellula ospite, spesso diversa da quella da cui origina il DNA da clonare, tramite l’utilizzo di molecole di DNA trasportatrici (vettori molecolari); la moltiplicazione delle cellule riceventi; la selezione delle cellule che effettivamente contengono la sequenza del DNA di interesse. © Zanichelli editore, 2014 5 5

6 L’isolamento del DNA di partenza
6 L’isolamento del DNA di partenza Il DNA da clonare può essere un segmento del genoma oppure una copia a DNA di un RNA messaggero (mRNA). Nel primo caso è possibile isolare anche sequenze non codificanti, come i promotori o gli introni presenti all’interno dei geni eucariotici. Nel secondo invece si può prelevare solo la sequenza espressa di un gene, allo scopo di fare esprimere la proteina corrispondente in un organismo diverso da quello originario: è questo l’approccio più usato in biotecnologia. © Zanichelli editore, 2014 6 6

7 7 Le biblioteche di cDNA La copia a DNA di un mRNA viene detta DNA complementare o cDNA. L’insieme dei cDNA clonati viene detto biblioteca di cDNA. © Zanichelli editore, 2014 7 7

8 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (I)
8 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (I) Per isolare gli mRNA di una cellula a partire dalla miscela di tutto l’RNA, si sfrutta la loro caratteristica di avere una sequenza all’estremità 3’, costituita da circa 200 residui di adenosina (coda poli-A). © Zanichelli editore, 2014 8 8

9 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (II)
9 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (II) La miscela degli RNA cellulari viene messa in contatto con una resina a cui sono attaccati dei corti oligonucleotidi costituiti da timidine (poli-T). © Zanichelli editore, 2014 9 9

10 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (III)
10 Le biblioteche di cDNA: isolamento degli mRNA cellulari (III) Gli mRNA vengono successivamente staccati dalla resina e raccolti in forma pura. © Zanichelli editore, 2014 10 10

11 Le biblioteche di cDNA: conversione degli mRNA in cDNA (I)
11 Per preparare i cDNA a partire da mRNA, si utilizza un enzima virale: la trascrittasi inversa (RT). Questa polimerasi, la cui scoperta fruttò il premio Nobel per la Medicina nel 1975 a David Baltimore e Howard Temin, è l’unico enzima esistente in grado di generare una copia di DNA a partire da una stampo di RNA e viene usato dai retrovirus come HIV per la replicazione del loro genoma. © Zanichelli editore, 2014 11 11

12 Le biblioteche di cDNA: conversione degli mRNA in cDNA (II)
12 La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell’mRNA, generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA. © Zanichelli editore, 2014 12 12

13 Le biblioteche di cDNA: conversione degli mRNA in cDNA (III)
13 La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento a RNA, esponendo la singola elica di DNA. © Zanichelli editore, 2014 13 13

14 Le biblioteche di cDNA: conversione degli mRNA in cDNA (IV)
14 La trascrittasi inversa sintetizza il filamento complementare di DNA, generando un cDNA a doppia elica. © Zanichelli editore, 2014 14 14

15 Le biblioteche di cDNA: i vettori di clonaggio (I)
15 Per inserire i cDNA all’interno di una cellula ospite si utilizzano molecole di DNA circolare: i vettori plasmidici. Si tratta di elementi genetici naturali dei batteri (plasmidi) modificati dall’uomo. © Zanichelli editore, 2014 15 15

16 Le biblioteche di cDNA: i vettori di clonaggio (II)
16 I vettori plasmidici contengono un’origine di replicazione per potersi duplicare insieme al DNA cellulare, un gene marcatore (resistenza a un antibiotico) per poter selezionare le cellule che li contengono e siti di taglio unici per enzimi di restrizione. © Zanichelli editore, 2014 16 16

17 Le biblioteche di cDNA: gli enzimi di restrizione (I)
17 Per preparare il cDNA e il vettore per il clonaggio è necessario utilizzare le endonucleasi di restrizione, enzimi batterici in grado di legarsi a specifiche sequenze del DNA (generalmente di 4 – 6 paia di basi) e tagliare la doppia elica all’interno della sequenza bersaglio. © Zanichelli editore, 2014 17 17

18 Le biblioteche di cDNA: gli enzimi di restrizione (II)
18 Il taglio genera estremità che possono essere piatte oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono coesive (sticky ends). © Zanichelli editore, 2014 18 18

19 Le biblioteche di cDNA: le ligasi
19 Per inserire il cDNA all’interno di un vettore è necessario utilizzare le DNA ligasi, enzimi presenti in tutte le cellule e in grado di ripristinare il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in una catena di DNA. In questo modo è possibile saldare insieme due frammenti di DNA distinti. © Zanichelli editore, 2014 19 19

20 Le biblioteche di cDNA: il clonaggio e la selezione (I)
20 I cDNA e il vettore di clonaggio vengono digeriti con la stessa endonucleasi di restrizione. In questo modo le estremità del vettore e quelle dei cDNA saranno complementari. © Zanichelli editore, 2014 20 20

21 Le biblioteche di cDNA: il clonaggio e la selezione (II)
21 Tramite la DNA ligasi i cDNA vengono saldati all’interno del vettore pasmidico. © Zanichelli editore, 2014 21 21

22 Le biblioteche di cDNA: il clonaggio e la selezione (III)
22 I DNA ricombinanti (cioè vettori contenenti i cDNA) vengono inseriti in cellule batteriche. © Zanichelli editore, 2014 22 22

23 Le biblioteche di cDNA: il clonaggio e la selezione (IV)
23 Le cellule geneticamente modificate (ovvero contenenti il vettore) acquisiranno la resistenza all’antibiotico portata dal vettore stesso, quindi le cellule sopravvissute conterranno tutti i cDNA. Ogni singola cellula originerà un clone di un singolo cDNA. L’insieme dei cloni sarà la biblioteca a DNA. © Zanichelli editore, 2014 23 23

24 Identificazione di un gene di interesse: il Southern Blotting (I)
24 Per identificare il clone della biblioteca che contiene il cDNA del gene di nostro interesse si può utilizzare il metodo del Southern Blotting, chiamato così dal suo inventore: Edwin M. Southern. Edwin Southern Immagine:Jane Gitschier (Plos Genetics)  © Zanichelli editore, 2014 24 24

25 Identificazione di un gene di interesse: il Southern Blotting (II)
25 Il Southern Blotting si compone di tre fasi principali: Elettroforesi sul gel di agarosio del cDNA separato dal vettore plasmidico estratto dai cloni, dopo digestione con endonucleasi di restrizione; Trasferimento dei frammenti di DNA dal gel a una membrana di nitrocellulosa; Ibridazione della membrana con un frammento di DNA complementare al cDNA di interesse marcato radioattivamente e rilevazione del segnale su lastra fotografica. © Zanichelli editore, 2014 25 25

26 Elettroforesi su gel di agarosio (I)
26 Elettroforesi su gel di agarosio (I) Il DNA plasmidico (vettore) estratto dai cloni viene digerito con gli stessi enzimi di restrizione usati per il clonaggio. In questo modo il cDNA viene separato dal vettore. Poi si prepara una miscela di agarosio all’ 1% in un opportuno tampone. L’agarosio è un polimero naturale che solidifica in un gel a temperatura ambiente. Una vasca piena di gel di agarosio solidificato. Immagine: Joseph Elsbernd via Wikimedia Commons © Zanichelli editore, 2014 26 26

27 Elettroforesi su gel di agarosio (II)
27 Elettroforesi su gel di agarosio (II) Nel gel vengono lasciate delle fessure (pozzetti) in cui si deposita la miscela contenente vettore e cDNA digeriti. © Zanichelli editore, 2014 27 27

28 Elettroforesi su gel di agarosio (III)
28 Elettroforesi su gel di agarosio (III) Applicando un campo elettrico, il DNA (carico negativamente) migra verso il polo positivo e le molecole si separano in base al peso molecolare. ll vettore (più pesante) correrà più lentamente del cDNA (più leggero). © Zanichelli editore, 2014 28 28

29 Trasferimento (blotting) su membrana
29 Il gel contenente il DNA separato, è sottoposto a un trattamento per denaturare il DNA, ovvero aprire i due filamenti. Il gel è poi appoggiato a una membrana di nitrocellulosa: il DNA migra dal gel alla membrana per capillarità o applicando un campo elettrico. La membrana, carica positivamente trattiene il DNA (a singola elica perché denaturato) carico negativamente. © Zanichelli editore, 2014 29 29

30 Ibridazione (I) 30 La membrana è immersa in una soluzione contenente un frammento di DNA a singola elica complementare al cDNA di interesse e recante un atomo di fosforo radioattivo (32P) all’estremità 5’.Grazie alla proprietà del DNA a singola elica di appaiarsi spontaneamente ad una sequenza complementare (ibridazione) la sonda radioattiva si legherà al cDNA di interesse. © Zanichelli editore, 2014 30 30

31 Ibridazione (II) 31 Il segnale ad alta energia del 32P viene catturato su una lastra fotografica, permettendo di identificare quale pozzetto conteneva il cDNA cercato. Dato che in ogni pozzetto era stato caricato il DNA di un singolo clone, con questa procedura è possibile risalire al clone della biblioteca che contiene il cDNA che cercavamo. . © Zanichelli editore, 2014 31 31

32 Clonaggio diretto di una sequenza genica: la PCR (I)
32 La reazione a catena della polimerasi (PCR) automatizza la reazione di duplicazione del DNA, utilizzando DNA polimerasi batteriche termostabili, cioè stabili ad alte temperature. Un termociclatore, la macchina usata per la PCR © Zanichelli editore, 2014 32 32

33 Clonaggio diretto di una sequenza genica: la PCR (II)
33 La miscela dei cDNA generata a partire dagli mRNA cellulari viene usata per una PCR. Gli oligonucleotidi complementari all’inizio e alla fine del cDNA di interesse funzionano da inneschi per la reazione di polimerizzazione. © Zanichelli editore, 2014 33 33

34 Clonaggio diretto di una sequenza genica: la PCR (III)
34 Attraverso ripetuti cicli di denaturazione, rinaturazione e polimerizzazione la sequenza originaria è amplificata per ogni ciclo n di un fattore 2n: 32 cicli = 232 =>109 copie. © Zanichelli editore, 2014 34 34

35 Clonaggio diretto di una sequenza genica: la PCR (IV)
35 Utilizzando inneschi che contengono le sequenze di taglio per endonucleasi di restrizione, le copie del cDNA di interesse generate per PCR possono essere direttamente inserite nei vettori di clonaggio con la DNA ligasi. © Zanichelli editore, 2014 35 35