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Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte
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Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia.
Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia. Sezione non colorata
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Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico
-Ecco perché occorre INCLUDERE -Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni. PARAFFINA RESINA MIX DI PARAFFINA E RESINE
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Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato.
I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo. Colorazione automatizzata
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Colorazioni Colorazione con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione del resto del tessuto con un colore contrastante
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Ematossilina/Eosina Ematossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). Eosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).
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Perchè questa "slide" è blu …
Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall'ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili
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… e questa rossa ? Se una porzione si colora in rosso /arancio /rosa, viene detta acidofila o eosinofila È colorata dall'eosina Sono proteine del citosol
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Altre colorazioni PAS Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
Tricromica (Azan Mallory) * Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa. Adiposo Bianco Le aree bianche sono lipidi
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Osmio o Sudan black Argento ed oro Giemsa Per grasso /lipidi/mielina
I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E Mielina Cellule nervose Cellule del sangue
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Come si osserva il campione?
Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita (˜ 8 micron)
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Interpretate il campione!!!
Dovete pensare in 3 dimensioni Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione
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Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali
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Microscopia Elettronica a Trasmissione
Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione
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MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.
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La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nm Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi
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Microscopia elettronica
-I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa -Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni semplicemente per dare contrasto o anche per marcare anticorpi
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Preparatione del campione Fissazione glutaraldeide Tetrossido osmio
Cellula eucariotica Nucleo interfasico Fissazione glutaraldeide Tetrossido osmio Deidratazione etanolo (passaggi) Inclusione Resine plastiche Taglio ultramicrotomo (spessore nm) Colorazione Metalli pesanti
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Preparazione di Campioni Biologici per TEM
1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) 2 Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.
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Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.
Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.
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Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro).
La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm. Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito nm).
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Montaggio delle sezioni su di una griglia.
Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo. Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini
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Vari tipi di Microscopia
Elettronica Transmissione (TEM) Scansione (SEM) Shadow-casting Freeze-fracture Freeze-etching CryoEM Negative Staining
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Microscopia Elettronica a Scansione
SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D
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IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)
Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l’interazione di un fascio di e- con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni
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Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso
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Tridimensionalità La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità - Ciglia e microvilli
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Glomerulo renale
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Preparazione dei campioni per SEM
Acquisizione del campione Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazione Non si include
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Poggiato su di un supporto e ricoperto con um metallo
Oro, cromo, palladio, carbone Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopio Fotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X
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