MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA

Presentazione sul tema: "MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA"— Transcript della presentazione:

1 MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Studi di associazione) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Minisatelliti (Diagnostica forense) Microsatelliti (Studi di associazione e diagnostica forense) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Studi di associazione anche per caratteri quantitativi)

2 Enzimi di restrizione 1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i filamenti quando questi vengono letti in direzione 5’- 3’; 2) Sporgenze al 5’ o al 3’; 3) Estremità coesive o non coesive; 4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza); 5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).

3 Enzimi di restrizione

4 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione

5 Identificazione di RFLP attraverso Southern blot
Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione Separazione dei frammenti per elettroforesi su agarosio Immobilizzazione DNA con trasferimento su membrana Ibridazione con sonda marcata Identificazione dell’ RLFP

6 Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

7 Identificazione del peso molecolare delle bande dopo corsa elettroforetica
DNA I: 19 mm = ~ 6,5 Kb 37 mm = ~ 1,2 kb DNA II: 20 mm = ~ 5 Kb 35 mm = ~ 1,6 kb

8 Identificazione di RFLP dopo corsa elettroforetica
3B 5B 7B B E 3 1 5 Dimensioni bande Non digerito: 15 kb EcoRI: 4, 5, 6 kb BamHI: 3, 5, 7 kb EcoRI + BamHI: 1, 3, 5 kb

9 Southern blot, Northern, Western …

10 Identificazione dell’allele S per la falcemia attraverso un RFLP nel gene beta della globina: quando la mutazione altera il sito di restrizione

11 Identificazione della segregazione di un allele patologico attraverso un RFLP quando la mutazione altera il sito di restrizione

12 Identificazione della segregazione di un allele patologico in una malattia mendeliana attraverso l’associazione con un RFLP

13 MINISATELLITI Sequenze ripetitive ipervariabili disperse nel genoma principalmente nei telomeri (9-64 bp in blocchi da 0,1 a 20 kb). Variabilità inter-individuale dovuta al numero di ripetizioni in tandem Un locus Un altro locus 1 2 3 Esempio: Sequenza di minisatellite: GGGCAGGAXC (core) simile alla sequenza “chi” di E. coli, segnale per la ricombinazione generalizzata

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15 Uso del fingerprint del DNA per scopi medico-legali
(minisatelliti di Jeffreys) (A) test di paternità (B) test per casi di violenza sessuale

16 VNTR: MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS)
Simple Tandem Repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a 100 bp) Variabilità inter-individuale per numero di ripetizioni in tandem

17 ESEMPIO DI ALLELI DI UN LOCUS MICROSATELLITE NEL GENOMA
Nel genoma umano ci sono circa: STR dinucleotidici 8.700 STR trinucleotidici STR tetranucleotidici 4.300 STR pentanlucleotidici 230 STR esanucleotidici

18 Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

19 Eredità di un locus microsatellite in una famiglia

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21 Tre loci microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati
con sequenziatore Marcatura di un primer di ogni PCR con diverso fluoroforo

22 Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore
Prodotti di ogni singola PCR marcati con coloranti fluorescenti

23 Microsatelliti analizzati con sequenziatore
Tutti gli alleli noti per ogni locus microsatellite marcati con fluorofori

24 Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti

25 Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti
1 sbagliato!

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27 IDENTIFICAZIONE DEL SESSO MEDIANTE PCR Y-SPECIFICA

28 MAPPA CROMOSOMICA DEI GENI AmelX E AmelY
Amelogenina: proteina presente nello smalto dei denti Primo esone del gene AmelY (pseudogene) più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX. Nel maschio: due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY). Nella femmina: due bande sovrapposte di 106bp (AmelX).

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30 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Solitamente 2 alleli Frequenti nel genoma (1 ogni kb) Tasso mutazione: ca 10-9 Tipizzazione con procedura sequenziamento automatizzato 1000 Genomes Project: identificati oltre 11 milioni di SNP in sequenze codificanti

31 Coppia di cromosomi omologhi
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Esempio: un soggetto eterozigote C/T Coppia di cromosomi omologhi In quella particolare posizione del genoma (locus) gli individui possono essere classificati con 3 possibili genotipi: omozigoti C/C, omozigoti T/T, o eterozigoti C/T

32 Analisi di SNP per lo studio delle relazioni evolutive

33 APLOTIPO Specifica combinazione di due o più alleli di marcatori del DNA situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di DNA. I polimorfismi per singolo nucleotide (SNP) sono i marcatori più frequenti utilizzati per costruire aplotipi. Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma ancestrale

34 Analisi della combinazione di SNP adiacenti: l’aplotipo
Individuo 1 Individuo 2 Specifica combinazione di due o più alleli SNP situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di DNA. Gli SNP sono i marcatori polimorfici più frequenti utilizzati per costruire aplotipi. Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma ancestrale

35 Formazione di aplotipi nel corso di un tempo evolutivo
Comparsa di 2 mutazioni Comparsa di 3 mutazioni Diversi tra loro per 5 SNP

36 APLOTIPO 1 2 3 1 2 3 4 Locus genico Alleli RFLP +/- +/- +/- Alleli SNP
introne esone 3’ UTR Locus genico Alleli RFLP +/- +/- +/- Alleli SNP C/T A/G C/T Popolazione A Aplotipi RFLP Aplotipi SNP + + - 1 + + 2 + 3 + - - 1 C G C 2 T G C 3 T A C 4 C A C

37 MAPPATURA RISPETTO AD APLOTIPO CON MARCATORI MICROSATELLITI DEL DNA
Possibile localizzazione gene malattia Rispetto ai marcatori sul braccio lungo del cromosoma, il gene patologico mappa prossimalmente rispetto a S129.