Clonaggio (molecolare)

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1 Clonaggio (molecolare)

2 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

3 1200 bp SacI EcoRI

4 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione

5 Purificazione acidi nucleici
Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi etanolo (Na, NH4) isopropanolo

6 Purificazione acidi nucleici

7 Purificazione acidi nucleici

8 Isolamento DNA plasmidico
Protocollo “classico” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

9 Protocollo classico Risospensione delle cellule in tampone con RNasi
Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

10 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

11 1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD)
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

12 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

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14 PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

15 GEL DI AGAROSIO

16 Elettroforesi su gel di agarosio

17 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

18 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

19 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

20 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

21 GEL DI AGAROSIO

22 al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

23 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

24 Visualizzazione del DNA

25 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

26 DNA superavvolto negativamente DNA circolare con superavvolgimento = 0

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28 ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2010/2011
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

29 1200 bp SacI EcoRI