Organizzazione delle unità di ripetizione dei geni per gli istoni in diverse specie.

Presentazione sul tema: "Organizzazione delle unità di ripetizione dei geni per gli istoni in diverse specie."— Transcript della presentazione:

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4 Organizzazione delle unità di ripetizione
dei geni per gli istoni in diverse specie

5 Tutti i genomi contengono copie multiple
dei geni per l’rRNA e per i tRNA

6 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

7 I PRECURSORI DEGLI rRNA SONO PIU' LUNGHI
DELLA SOMMA DEI DUE rRNA MATURI

8 I precursori degli rRNA subiscono maturazione

9 I geni per gli rRNA sono ripetuti in tandem nei genomi eucariotici
ETS 18S ITS 28S NTS RNA RNA DNA DNA gene promoter 60/81 bp repeats spacer other repetitive elements DNA

10 Amplificazione DNA Clonaggio PCR

11 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni
Minicromosomi artificiali

12 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

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14 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

15 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

16 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

17 Uso degli enzimi di restrizione
Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

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19 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

20 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

21 Elementi di un vettore plasmidico
Origine di replicazione Marcatore di selezione Sito di restrizione unico

22 Vettori plasmidici

23 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

24 Preparazione del DNA da clonare
Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione meccanica Collezione DNA (banca, genoteca) cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta

25 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Collezioni di DNA clonato (banca cDNA, genoteca) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

26 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
RNA PREPARAZIONE del cDNA DNA Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

27 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

28 Unione, mediante ligasi,
di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI G CTTAA AATTC INSERTO GAATTC CTTAAG DNA ligasi

29 Reazione di ligasi strategie controlli

30 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare
mediante ligasi di estremità coesive VETTORE GAATTC CTTAAG AATTC G G CTTAA EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI GAATTC CTTAAG INSERTO

31 Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi
 pAATTC G AATTC G  G CTTAAp G CTTAA fosfatasi  GpAATTC CTTAA G G AATTC CTTAApG DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI GAATTC CTTAAG

32 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA   AGCTT A G CTTAA  GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

33 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

34 Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2 Elettroporazione In E.coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di Elettroporazione eucarioti superiori Microiniezione DNA gun

35 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

36 Vettori plasmidici

37 Strategie di selezione nel clonaggio
resistenza AMPICILLINA AMPICILLINA

38 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

39 1200 bp SacI EcoRI

40 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione

41 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

42 1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD)
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

43 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

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45 Elettroforesi su gel di agarosio

46 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

47 al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

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49 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

50 Visualizzazione del DNA

51 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

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53 Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)
Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

54 Agarosio o acrilammide
BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite Sonda Gel Southern DNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Northern RNA Western Proteine Anticorpi Acrilammide

55 Metodi di trasferimento
Capillare Elettroblot

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57 Assemblaggio del blot capillare
vaschetta carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto tampone

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59 Fattori che influenzano l’ibridazione
Temperatura Forza ionica pH

60 Esempio di Southern blot genomico

61 Analisi di espressione
(mRNA)

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