La Robustezza secondo RDC-166

Presentazione sul tema: "La Robustezza secondo RDC-166"— Transcript della presentazione:

1 La Robustezza secondo RDC-166

2 L’esercizio rende robusti?

3 Sezione IX ROBUSTEZZA Art. 62 Per metodi quantitativi l’impatto delle variazioni sul risultato ottenuto deve essere verificato con gli stessi criteri utilizzati per l’accuratezza. Art. 64 Deve essere verificata la conformità ai criteri di System Suitability.

4 Questi articoli in combinazione con la Tabella I dell’annesso III fanno della robustezza una delle parti più onerose della validazione secondo RDC-166. In partica per un metodo HPLC si tratta di ripetere l’accuratezza al 100% in 9 condizioni diverse. Questa slide è identica all’ultima slide della presentazione dell’anno scorso. Questa volta esploreremo i “dettagli” della robustezza con l’intento di verificare quanto siano utili nel modo reale.

5 ICH contro RDC ICH Q2(R1) The evaluation of robustness should be considered during the development phase and depends on the type of procedure under study. It should show the reliability of an analysis with respect to deliberate variations in method parameters If measurement are susceptible to variations in analytical conditions, the analytical conditions should be suitably controlled or a precautionary statement should be included in the procedure.

6 Detta così sembra che lo scopo della robustezza sia di arrivare a definire i parametri di System suitability del metodo. L’ingenuo analista che leggesse le linee guida ICH senza una conoscenza diretta del mondo reale penserebbe di poter utilizzare tranquillamente i dati di sviluppo… …purtroppo non è così, e a toglierci ogni dubbio ci pensa la RDC166.

7 Art. 61 Robustness is a parameter typically used to develop an analytical method, which indicates its capacity to resist small and deliberate variation on the analytical conditions. Questo è un ipocrita paragrafo di circostanza messo solo per collegarsi alle ICH, perché subito dopo la RDC166 svela la sua vera natura:

8 Art. 62 For quantitative methods, the impact of variations proposed on the result obtained must be assessed with the same criteria used for accuracy. Art. 63 For qualitative methods, it must be verified if the variations proposed interfere with the analytical response. Art. 64 Compliance with the system suitability must be evidenced. Art. 65 The assessment of parameters described on Table I of annex III must be considered for the validation report.

9 E’ evidente già dal numero dei must impiegati nel testo che c’è poco da discutere… Per ribadire il concetto: §2° Lack of assessment of any of the variations must be justified. Vediamo allora cosa c’è nella Tabella I dell’annesso III:

10 Table 1: Conditions to assess the method robustness.
Sample preparation Analytical sample stability Extraction time Filter compatibility Spectrophotometry pH variation of the mobile phase Different batches or solvent manufacturer Liquid chromatography Composition variation of the mobile phase Different batches or column manufacturers Temperature Mobile phase flow Gas chromatography Speed of carrier gas Other analytical techniques Variations to be tested must be critically assessed and their results must be presented

11 Tenendo conto degli articoli 62 e 64 l’approccio più semplice ad un esperimento di robustezza è quello che prevede una sequenza di questo tipo: - System suitability - Calibrazione - Ripetizione del test di accuratezza al 100% Immaginando di applicare questa sequenza ad un tipico metodo HPLC “moderno” da 1 ora a ciclo, possiamo stimare un tempo totale per ogni condizione di circa 14 ore di cui 8 spese tra bianchi, system e calibrazione e 6 all’effettiva esecuzione dell’accuratezza.

12 Il test va ripetuto per ciascuna delle condizioni da variare, quindi:
1 Variazione pH a scendere, tipico -0,2 unità di pH 2 Variazione pH a salire, tipico +0,2 unità di pH 3 Fase mobile meno forte, tipico -2% di solvente organico (fase inversa) 4 Fase mobile più forte, tipico +2% di solvente organico (fase inversa) 5 Differente colonna, tipico stessa marca, lotto diverso 6 Temperatura più bassa, tipico -5°C al comparto colonna 7 Temperatura più alta, tipico +5°C al comparto colonna 8 Flusso fase mobile più basso, tipico -10% 9 Flusso fase mobile più basso, tipico +10% Se tutto va bene, dopo 126 ore di test (circa 5 giorni e ½), avremo la nostra robustezza secondo RDC166.

13 Ma tutto questo esercizio (di validazione), ci ha davvero resi più robusti?

14 SECONDO ME NO L’unico effetto positivo di questo esercizio sarà di rendere felice il revisore brasiliano! …ma l’impatto sulla reale solidità del nostro metodo sarà praticamente nullo.

15 Variazioni 1 & 2 Forse questo è il caso più tipico di un parametro che andrebbe valutato in sede di sviluppo del metodo e non in validazione. Ci sono metodi totalmente insensibili al pH della fase mobile e metodi sensibilissimi, dove anche una variazione inferiore a 0,05 unità può fare la differenza.

16 Nel caso di analiti ionizzabili il controllo del pH è fondamentale per regolare la ritenzione, l’effetto delle variazioni di pH dovrebbe far parte della descrizione del metodo piuttosto che dei test di robustezza. Un esempio di questo è lo sviluppo fatto nel nostro laboratorio di un metodo da proporre alla Farmacopea Europea.

17 Il metodo era stato sviluppato per separare l’API da tre impurezze denominate A, B e C. L’impurezza C non è ionizzabile, mentre il prodotto e le impurezze A e B si. Per la separazione era stato trovato un pH apparente ottimale di 6,5 e le seguenti condizioni di system suitability: Retention time of impurity B: not less than 2 minutes Tailing of impurity A: not more than 1.5 Column performance: not less than 9000 theoretical plates measured on the peak of impurity A

18 Questa system suitability era accompagnata da queste istruzioni: If necessary adjust the acetonitrile content to obtain a retention time for impurity C peak between 16 and 20 minutes. Then, if necessary, adjust the apparent pH of the mobile phase to obtain for impurity B peak a retention time greater than 2 minutes and for the API peak a retention time not greater than 16 minutes

19 In sede di validazione questo era stato dimostrato nella robustezza con le seguenti prove:
Variazione 1: pH a 6,0 anziché 6,5 (meno 0,5 unità di pH) Variazione 2: pH a 7,0 anziché 6,5 (più 0,5 unità di pH) Variazione 3: fase mobile meno forte con 30% di acetonitrile anziché 33% (9% in meno di solvente organico) Variazione 4: fase mobile più forte con 36% di acetonitrile anziché 33% (9% in più di solvente organico) Le variazioni sono molto grandi, ma il metodo funziona sempre:

20 Cromatogramma System Suitability Solution come da metodo

21 Variazione 1: pH a 6,0 anziché 6,5 L’API e le impurezze A e B anticipano rispetto allo STD

22 Variazione 2: pH a 7,0 anziché 6,5 L’API e le impurezze A e B ritardano rispetto allo STD. C resta più o meno costante

23 Variazione 3: 30% CH3CN anziché 33% Tutti i picchi ritardano

24 Variazione 3: 36% CH3CN anziché 33% Tutti i picchi anticipano

25 Si dimostra che il metodo è robusto con chiare istruzioni su come gestire i parametri critici…
…risultato: Pubblicazione in Farmacopea con questa system suitability… Resolution: minimum 3.0 between the peaks due to API and impurity C E soprattutto senza spiegazione…!

26 Variazioni 3 & 4 La modifica tipica dei parametri che troviamo in questa variazione ±2% è quella che ritroviamo (semplificando) come modifica ammessa ai parametri dei metodi di farmacopea. In realtà questo approccio è molto grossolano, perché una modifica del 2% ad un componente (anche tendo conto dei “cavilli” correttivi introdotti dalle farmacopee) può esser poco o tantissimo, in funzione delle caratteristiche del metodo.

27 Variazione 5 Sempre prendendo come esempio un metodo HPLC quello che si fa normalmente è di valutare lotti diversi della stessa fase. Questa attività sembrerebbe utile, fornendo informazioni sulla variabilità della fase stazionaria. Purtroppo sviluppo del metodo e validazione avvengono in tempi relativamente brevi. Anche se le colonne sono state impaccate da lotti di fase stazionaria diverse queste saranno state prodotte da lotti ottenuti in tempi vicini se non addirittura consecutivi. L’esperienza dice che le variazioni di fase stazionaria avvengono a tempi lunghi, spesso dopo anni di produzione della stessa fase.

28 Su questo tema ho un esempio interessante:
Uno dei temi connessi alla robustezza è la verifica dei parametri di System suitabilty. Viene infatti richiesto di ripresentare i dati e di commentare eventuali deviazioni. E’ atteso comunque che i parametri di System suitability siano rispettati per tutte le variazioni. Dal punto di vista della specificità quello che si fa normalmente è di selezionare una “coppia critica”, generalmente la meno risolta, e di definire su questa un criterio di risoluzione.

29 Ma la “coppia critica”…
…E’ VERAMENTE CRITICA?

30 Questo esempio è preso dalla USP
Questo esempio è preso dalla USP. Il metodo prevede una risoluzione minima tra la coppia “impurezza anidro” e “impurezza 3-deossi-3-cloro” non inferiore a 1. E’ una risoluzione molto bassa ed è perfettamente logico che sia stata selezionata come coppia critica. Questa è l’implementazione originale del metodo (2015), utilizzando la colonna originale specificata nelle note alla monografia si ottiene un cromatogramma molto simile a quello pubblicato:

31 Cromatogramma USP

32 Cromatogramma ottenuto nel nostro laboratorio

33 Nel 2019 però, al primo uso di una nuova colonna:

34 La risoluzione tra i due picchi della coppia critica è mantenuta, ma due delle altre impurezze coeluiscono. Questo non è un PROBLEMA, ma UN GROSSO PROBLEMA, perché mentre le due impurezze della coppia critica sono di processo, le due impurezze che coeluiscono sono di degradazione!

35 Variazioni 6 & 7 Queste sono le specifiche tipiche dei termostati per colonna in commercio: Accuratezza della temperatura: ±0,8°C Che senso ha modificare la temperatura di ±5°C? Poteva avere senso quando le colonna erano lasciate a temperatura ambiente, ma con le necessità di oggi questo non è più possibile. Anche la scelta della temperatura è un problema di sviluppo analitico, l’esecuzione di questo test in sede di validazione non ha alcuna utilità pratica.

36 Variazioni 8 & 9 Le variazioni 8 e 9 sono le più inutili di tutte. Utilizzando le attuali colonne con dimensioni delle particelle di 5 µm o inferiori, una variazione del 10% sul flusso non ha praticamente nessun effetto sui piatti teorici e quindi sull’efficienza della separazione. L’unico risultato negativo che si può ottenere è di “spingere” l’ultimo picco eluito fuori dal cromatogramma. Può essere utile per definire un parametro di system suitability relativo al tempo di ritenzione di un picco di riferimento…ma questo dovremmo averlo già fatto in sede di sviluppo del metodo!

37 GRAZIE DELLA PAZIENZA! Dr. Marco Radice
Si ringrazia la dottoressa Dora Dones per l’aiuto nella preparazione della presentazione