Estrazione composti fenolici

Presentazione sul tema: "Estrazione composti fenolici"— Transcript della presentazione:

1 Estrazione composti fenolici
The extraction of bioactive compounds from plant materials is the first step in the utilization of phytochemicals in the preparation of dietary supplements or nutraceuticals, food ingredients, pharmaceutical, and cosmetic products. Usually before extraction plant samples are treated by milling, grinding and homogenization, which may be preceded by air-drying or freeze-drying.

2 Estrazione composti fenolici
Solvent extractions are the most commonly used procedures to prepare extracts from plant materials due to their ease of use, efficiency, and wide applicability. Extraction depends on the type of solvents with varying polarities, extraction time and temperature, sample-to-solvent ratio as well as on the chemical composition and physical characteristics of the samples.

3 Estrazione composti fenolici
Phenolics can be extracted from fresh, frozen or dried plant samples. The solubility of phenolics is governed by the chemical nature of the plant sample, as well as the polarity of the solvents used. Plant materials may contain phenolics varying from simple (e.g., phenolic acids, anthocyanins) to highly polymerized substances (e.g., tannins) in different quantities.

4 Estrazione composti fenolici
Moreover, phenolics may also be associated with other plant components such as carbohydrates and proteins. Therefore, there is no universal extraction procedure suitable for extraction of all plant phenolics. Depending on the solvent system used during exaction, a mixture of phenolics soluble in the solvent will be extracted from plant materials. It may also contain some non-phenolic substances such as sugar, organic acids and fats. As a result, additional steps may be required to remove those unwanted components.

5 CONTENUTO FENOLICO TOTALE (Total Phenolic Content TPC)
La determinazione del TPC è generalmente effettuata con il metodo di Folin-Ciocalteau, che utilizza il reattivo di Folin-Ciocalteau costituito da una miscela di acido fosfotungstico (H3PW12O40) e acido fosfomolibdico (H3PMo12O40). In presenza di composti fenolici il reattivo si riduce a miscela di ossidi di tungsteno e molibdeno (W8O23 e Mo8O23) e si sviluppa una colorazione blu la cui intensità può essere letta, utilizzando uno spettrofotometro UV-Visibile, alla lunghezza d’onda di 765 nm.

6 Legge di Lambert-Beer A = bC ~ A = Assorbanza = Log (Io /I)
I = Intensità di emissione di una sorgente  = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare, l’assorbanza di una soluzione 1M b = cammino ottico C = concentrazione della sostanza che assorbe la luce I0 ~ I Sorgente di emissione Rivelatore Campione b

7 CONTENUTO FENOLICO TOTALE (Total Phenolic Content TPC)
Per convenzione il contenuto di polifenoli si esprime in mg/L di acido gallico equivalenti (GAE).

8 LO STRESS OSSIDATIVO E LE SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO (ROS/RNS)
Le cause della pericolosità dell’ossigeno sono rimaste ignote fino alla pubblicazione della teoria dei radicali liberi di Gershman, che attribuì la tossicità dell’ossigeno alle sue forme ridotte.

9 LO STRESS OSSIDATIVO E LE SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO (ROS/RNS)
ROS e RNS sono prodotti del normale metabolismo cellulare e svolgono un duplice ruolo, benefico e deleterio, a seconda della loro concentrazione e localizzazione nell’organismo. Gli effetti positivi dei ROS si osservano a concentrazione bassa o moderata: queste specie sono inoltre coinvolte nella difesa nei confronti di agenti infettivi e nella trasduzione di segnali cellulari. Gli effetti dannosi di ROS e RNS si osservano quando si incorre nello “stress ossidativo”: una modificazione nel delicato equilibro ossidanti/antiossidanti, che si verifica quando si ha una sovrapproduzione di ROS/RNS o una deficienza di antiossidanti. I ROS reagiscono con lipidi, proteine e DNA, modificandoli e così inibendo le loro normali funzioni.

10 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
I metodi esistenti per l’identificazione delle proprietà antiossidanti si possono dividere in due grandi classi: metodi che permettono la valutazione della capacità di scavenger nei confronti di specifici ROS/RNS; 2) metodi che valutano la capacità di scavenger nei confronti di radicali non biologici stabili. Tali radicali non sono presenti in natura, ma il loro utilizzo permette di ottenere una quantificazione del potere antiossidante in modo più semplice e rapido, in quanto generalmente sono disponibili commercialmente e si degradano lentamente.

11 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
metodi che permettono la valutazione della capacità di scavenger nei confronti di specifici ROS/RNS: I metodi che misurano la capacità di scavenger nei confronti di radicali biologici sono quelli che riflettono maggiormente ciò che accade in vivo, in quanto durante l’analisi si riproduce esattamente il comportamento tipico della molecola antiossidante all’interno dell’organismo. In genere in questi saggi è applicato uno schema di tipo competitivo, nel quale la molecola antiossidante ed un’altra molecola target reagiscono con il radicale ROO•.

12 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
In questo tipo di metodi sono coinvolti tre elementi:

13 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
Nello schema competitivo la presenza dell’antiossidante inibisce o ritarda l’ossidazione della molecola target indotta dal radicale perossilico. La velocità di ossidazione del composto target può essere misurata attraverso diverse modalità, così come si possono utilizzare diverse molecole come target

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metodi che permettono la valutazione della capacità di scavenger nei confronti di specifici ROS/RNS: METODO ORAC METODO DELL’INIBIZIONE DELLA PEROSSIDAZIONE LIPIDICA

15 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
METODO ORAC Il metodo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) è uno dei metodi più comuni per la determinazione della capacità di scavenger nei confronti di radicali perossilici. Il principio del saggio è basato sulla misura della diminuzione dell’intensità di fluorescenza di una molecola target fluorescente (ad esempio fluoresceina), sotto un flusso costante di radicali perossilici, generati dalla decomposizione termica di un azocomposto.

16 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
METODO ORAC La velocità della decomposizione della fluoresceina viene rallentata dalla presenza di antiossidanti. La reazione è condotta per tempi lunghi (superiori ai 30 minuti) e la quantificazione del potere antiossidante viene effettuata misurando la differenza tra l’area sottesa alla curva che rappresenta l’ossidazione della fluoresceina in assenza ed in presenza di antiossidante Trolox

17 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
METODO ORAC

18 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
METODO DELL’INIBIZIONE DELLA PEROSSIDAZIONE LIPIDICA In questo metodo viene indotta artificialmente l’ossidazione di acido linoleico o di LDL (Low Density Lipoprotein) in presenza di ossigeno, catalizzata da Cu (II) o da un azo‐composto. La reazione viene condotta in solvente organico ed il progresso dell’auto‐ossidazione può essere monitorato misurando l’assorbanza a 234 nm, lunghezza d’onda di massimo assorbimento del lipide perossido che si forma.

19 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
METODO DELL’INIBIZIONE DELLA PEROSSIDAZIONE LIPIDICA

20 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
2) metodi che valutano la capacità di scavenger nei confronti di radicali non biologici stabili. MISURA DELL’ATTIVITA’ DI RADICAL SCAVENGING (Saggio del DPPH) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

21 Saggio del DPPH La prova permette di determinare il potere antiossidante facendo reagire il campione da analizzare con una soluzione di DPPH ed analizzando all'UV la diminuzione in assorbanza del picco a 517 nm del radicale.

22 Saggio del DPPH

23 Saggio del DPPH Composti antiossidanti (AH) che sono capaci di trasferire un atomo di idrogeno al radicale, causano una decolorazione della soluzione. Si analizza quindi all’UV-Vis la diminuzione dell’assorbanza del picco a 517 nm del radicale (DPPH) dopo un tempo di incubazione prestabilito. Questa diminuzione (decolorazione) è proporzionale alla carica antiossidante presente nel campione.

24 ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
Saggio del DPPH I risultati sono generalmente espressi come equivalenti di Trolox (acido 6‐idrossi‐2,5,7,8‐tetrametilcroman‐2- ‐carbossilico).