Laboratorio Proteomica

Presentazione sul tema: "Laboratorio Proteomica"— Transcript della presentazione:

1 Laboratorio Proteomica
M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di Proteomica Applicata alla Biomedicina Marco Gaspari

2 Argomenti Nozioni di analisi proteomica
Gel elettroforesi bidimensionale Elementi costitutivi dello spettrometro di massa Ionizzazione MALDI Ionizzazione ESI Analizzatore a tempo di volo Spettrometria di massa in tandem Identificazione di proteine tramite PMF o MS/MS Applicazioni cliniche

3 Analisi proteomica

4 Analisi proteomica

5 Gel elettroforesi 2D: prima dimensione
Caricamento del campione + - Applicazione voltaggio Isoelettrofocalizzazione (separazione in funzione del punto isoelettrico) + - 4 5 6 7 Gradiente di pH pI = 4.2 pI = 5.2 pI = 6.8

6 Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione
Aggiunta SDS

7 SDS PAGE (separazione in funzione delle massa)
Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione - SDS PAGE (separazione in funzione delle massa) Campo elettrico +

8 Analisi proteomica

9 Lista di proteine differenzialmente presenti nel tessuto tumorale
Analisi proteomica Lista di proteine differenzialmente presenti nel tessuto tumorale

10 La spettrometria di massa e’ una sofisticata tecnica analitica in grado di:
Determinare il peso molecolare di una grande varieta’ di molecole e biomolecole (peptidi, proteine) Fornire informazioni strutturali sulle proteine, e sulle loro modificazioni post-traduzionali. Effettuare analisi quantitativa sia di piccole molecole che di biomolecole, fornendo alta sensibilita’ ed elevata specificita’

11 Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica
Spettrometria di massa Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. John Fenn, Premio Nobel per la Chimica 2002 Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica m/z

12 Spettro di massa m/z 1D PAGE M1+ % Intensity M2+ 100 4999 32000 59001
4999 32000 59001 86002 113003 140004 m/z 1D PAGE

13 Camera di ionizzazione
Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Analizzatore Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

14 Camera di ionizzazione
Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Analizzatore Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

15 Costruito il primo spettrometro di massa
Ionizzazione Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione. Il processo richiede energia Costruito il primo spettrometro di massa ESI 1907 1966 FAB 1984 1985 MALDI CI EI 1981 1900 1925 1950 1975 2000

16 Tipi di ionizzazione (1)
Protonazione + NH3 M + H+  MH+ Deprotonazione O M - H+  [M-H+]- - O

17 Tipi di ionizzazione (2)
OH Addizione cationica M + Na+  MNa+ Na+ OH Espulsione di elettroni +. - e- CH3 M  M+.

18 Principali tecniche di ionizzazione
Ionizzazione “hard” EI (electron impact) Ionizzazioni “soft” MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation) ESI (electrospray ionisation)

19 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il campione di partenza e’ in genere in soluzione. L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’ fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica. La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite un impulso laser

20 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
HO HO Matrice COOH COOH OH H CN DHB CHCA Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero) Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV)

21 MALDI- preparazione del campione
Soluzione di matrice Soluzione campione Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso) Depositare sulla piastra metallica (1 μL) Piastra metallica Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi Lasciare cristallizzare Piastra metallica

22 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
+ 20 kV Impulso laser + + + + All’analizzatore + + + Piastra metallica + + + + Matrice + Proteina

23 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
Genera per lo piu’ specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) 100 20900 10451 % Intensity 10700 20000 24000 m/z

24 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
Genera per lo piu’ specie monocariche Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) [M+H]+ 100 20900 [M+2H]2+ 10451 % Intensity 10700 20000 24000 m/z

25 Elettrospray - ESI La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare. L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

26 Elettrospray - ESI Campo elettrico sufficiente Ionizzazione +
Polo positivo Polo negativo + V + 50 V - + + + + + + + + + - - + + - + + + + - + + - + + + + + + MS inlet - - - + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + + - - + + + + + + - + - + + + + + - + + - Alimentatore

27 L’elettrospray genera ioni multicarica
Goccia generata da elettrospray La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica.

28 MALDI & ESI: interleuchina 6
100 20900 10451 Mw=20899 MALDI % Intensity 10700 20000 24000 m/z 100 909.86 996.48 872.01 951.19 805.03 Mw=20904 775.27 % intensity ESI 747.63 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

29 Camera di ionizzazione
Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI L’analizzatore svolge il compito di separare gli ioni secondo il loro rapporto m/z prima che essi arrivino al rivelatore Analizzatore Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

30 Assenza di campo elettrico
Analizzatore a tempo di volo Ek= ½ mv2 Ionizzazione + + + Campione Pusher, kV Rivelatore Campo elettrico Assenza di campo elettrico

31 Analizzatore a tempo di volo
In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo. Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli.

32 Camera di ionizzazione
Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione MALDI, ESI Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo Analizzatore Rivelatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

33 Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni
Serie di dinodi Uno ione dall’analizzatore 106 elettroni L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato

34 Spettrometro MALDI-TOF
Rivelatore Ionizzazione MALDI TOF Laser Segnale amplificato Piastra metallica Intensita’ Tempo (m/z)

35 Spettro MALDI-TOF di una Fosfoproteina
23010 1 phosphorylation 22930 23090 2 phosphorylations No phosphorylation Intensity Intensity Rel. Rel. m/z m/z

36 Identificazione di batteri mediante MALDI-TOF

37 Spettrometro ESI-TOF La ionizzazione MALDI e’ pulsata (con la frequenza del laser), percio’ si presta bene per essere collegata ad un analizzatore TOF. ESI e’ una sorgente continua di ioni. L’accoppiamento ESI-TOF richiede una speciale geometria che unisca la sorgente continua di ioni con un’analisi TOF di tipo pulsato (geometria ortogonale).

38 ESI-QqTOF analizzatore ibrido
pusher rivelatore ESI Quadrupolo Quadrupolo m/z Intensita’ 100 1000

39 E’ necessario usare la spettrometria di massa in tandem
Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) ESI e MALDI generano ioni causando minima frammentazione nelle molecole. Questo implica che l’unica informazione ottenibile dall’analisi e’ una misura piu’ o meno accurata del peso molecolare dell’analita. Cio’ non e’ sufficiente per una dettagliata caratterizzazione strutturale di peptidi e proteine (struttura primaria, modifiche post-traduzionali). E’ necessario usare la spettrometria di massa in tandem

40 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)
La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi. MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z MS2: MS/MS su m/z 850.1 Selezione del picco 100 100 650.4 198.6 678.8 850.1 Intensita’ Intensita’ 466.7 401.3 80.4 850.1 1000 1000 m/z m/z

41 Q1: Camera di collisione
Qq-TOF : analisi MS/MS pusher Rivelatore Da ESI Q1: Camera di collisione Q0: selezione m/z Relative intensity (%) 100 1000 Full scan MS m/z Relative intensity (%) 100 1000 MS/MS su

42 Analisi quantitativa: standard interno
In spettrometria di massa quantitativa, viene fatto largo uso di standard interni contenenti isotopi pesanti non radioattivi (deuterio - D, 13C). In figura è rappresentato uno ipotetico standard interno (D3) per la creatinina (a destra). Lo standard interno avrà efficienza di ionizzazione e ritenzione cromatografica praticamente identica alla creatinina, ma verrà rilevato ad un m/z maggiore (+3 m/z). Dal rapporto tra il segnale dell’analita e quello dello standard interno si potrà risalire alla concentrazione incognita dell’analita

43 Newborn Screening workflow
MS spectrum Flow injection MS Take supernatant

44 C5-DC Free carnitine GA-I CPT-I/II VLCAD PKU MSUD MCD PA/MMA
Omocisteinuria Citrullinemia Argininemia MCD C5-DC

45 PKU (fenilchetonuria)
PKU è il risultato di un difetto nell’enzima fenilalanina idrossilasi, il quale trasforma Phe in Tyr (amminoacido di norma non essenziale, ma che in PKU diventa essenziale). Difetti in tetraidrobiopterina, un cofattore per PAH, può portare, in rari casi, a PKU.

46 Sandra et al. J Perinat Neonat Nurs 2004
Casi positivi Sandra et al. J Perinat Neonat Nurs 2004

47 Deficit di MCAD MCAD consiste in un difetto del metabolismo degli acidi grassi a catena media. L’enzima, un acil-CoA deidrogenasi mitocondriale, catalizza i passaggi iniziali della beta ossidazione per acidi grassi a catena lunga tra i 6 e I 12 atomi di carbonio.

48 Casi positivi GA-I

49 Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa
La determinazione del peso molecolare della proteina intatta non e’ un’informazione sufficiente. Nonostante nuove tecniche basate sulla frammentazione di proteine intatte siano in rapida evoluzione, generalmente l’approccio standard per l’identificazione di una proteina e’ l’analisi spettrometrica del digerito triptico della proteina stessa.

50 Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa
Ricerca in banca dati Digestione triptica Analisi spettrometrica del digerito

51 Approccio 1: peptide mass fingerprinting (PMF)
Il peso molecolare dei peptidi ottenuti mediante digestione triptica e’ analizzato tramite spettrometria di massa. La lista dei pesi molecolari di un buon numero di peptidi triptici ( > 5) e’ spesso un’informazione sufficiente per identificare una proteina (o, piu’ specificatamente, il gene da cui essa proviene).

52 Pesi molecolari rilevati sperimentalmente
PMF: esempio Digestione triptica Lys, Arg 100 1885.2 748.6 1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4 1606.7 Intensita’ (%) 1378.8 650.4 m/z 2000 Pesi molecolari rilevati sperimentalmente Spettro MALDI-TOF

53 PMF: esempio La lista di peptidi acquisita sperimentalmente viene confrontata con i digeriti teorici presenti nella banca dati. 1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4 Dato sperimentale ? ? ? Digeriti triptici in silico: peso molecolare previsto per i peptidi triptici appartenenti a tre proteine “modello” Citocromo C Mioglobina Lattalbumina 964.53 779.45 678.38 634.39 604.35 547.27 748.43 708.32 662.33 650.31 631.34 653.31 650.32 618.34 549.28

54 MS/MS di peptidi b + y+ b+ + y M+ M+
Nello spettrometro di massa, durante esperimenti MS/MS, i peptidi tendono a frammentare in corrispondenza del legame ammidico. M+ b + y+ M+ b+ + y

55 MS/MS di un peptide T A S K T A T T A S K A S S K A S K MS/MS
Thr-Ala-Ser-Lys m/z Intensita’ 100 405 Spettro MS Spettro MS/MS m/z Intensita’ 100 500 405 353 301 201 170 156 248 500

56 Per un peptide composto da n ammino acidi:
MS/MS di peptidi b1 b2 b3 O O R1 R3 HN HN NH H2N OH O R2 O R4 y3 y2 y1 Per un peptide composto da n ammino acidi: Inoltre: b1 = Mres + H+ b2 = b1 + Mres bn-1 = MH Mres y1 = Mres H+ y2 = y1 + Mres yn-1 = MH+ - Mres - H2O nel caso di D, E, S, T - NH3 nel caso di N, Q, K, R

57 MS/MS di peptidi …..GLN… y3 314 y5 y2 484 200 y4 427
Per interpretare uno spettro MS/MS di un peptide, si parte in genere da un estremo, superiore o inferiore, dello spettro, cercando di individuare potenziali serie di ioni b o y. Le differenze tra i vari ioni b (o y) nella serie, corrispondono alle masse residue degli amminoacidi componenti la sequenza del peptide. Attenzione: la frammentazione e’ piu’ o meno favorita in diversi punti della sequenza del peptide; l’intensita’ dei frammenti risultanti sara’ dunque variabile ( e spesso il frammento potrebbe essere assente, interrompendo la serie). y3 Intensita’ 314 …..GLN… y5 L y2 484 200 y4 N 427 G m/z

58 Masse residue di alcuni ammino acidi
MS/MS di peptidi Masse residue di alcuni ammino acidi b1 = Mres + H+ b2 = b1 + Mres bn-1 = MH Mres y1 = Mres H+ y2 = y1 + Mres yn-1 = MH+ - Mres Ala 71 Pro 97 Leu 113 Asn 114 Thr 101 Val 99 Lys 128 Phe 147 Intensita’ 186 314 M + H+ 592 427 574 166 279 521 407 m/z

59 Masse residue di alcuni ammino acidi
MS/MS di peptidi Masse residue di alcuni ammino acidi b1 = Mres + H+ b2 = b1 + Mres bn-1 = MH Mres y1 = Mres H+ y2 = y1 + Mres yn-1 = MH+ - Mres Ala 71 Pro 97 Leu 113 Asn 114 Thr 101 Val 99 Lys 128 Phe 147 Ala – Asn – Lys – Leu - Phe Intensita’ b3 b2 186 314 M + H+ 592 b4 y2 y1 MH+ - H2O 427 574 166 279 y4 y3 521 407 m/z

60 Identificazione di proteine approccio 2: MS/MS ion search
Digestione triptica 100 1885.2 748.6 1606.7 Intensita’ (%) MS/MS ion search (2) 1378.8 650.4 PMF (1) m/z 2000 Spettro MS

61 Identificazione di proteine tramite MS/MS
m/z Intensita’ (%) 100 2000 650.4 748.6 1378.8 1606.7 1885.2 m/z Intensita’ (%) 100 2000 1885.2 m/z Intensita’ (%) 100 2000 1606.7 748.6 m/z Intensita’ (%) 2000 1378.8 m/z Intensita’ (%) 100 2000 650.4 m/z Intensita’ (%) 100 2000

62 Spettro MS/MS di un peptide acetilato
1460.5 100 b2 b4o b7 b10o b12 b13 b14 b15 y12 Y L S T P I F S K(Ac)L A Q W S N K y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y6 y10 y9 Relative Abundance y4 [M+2H-2H2O]+2 733.2 1250.4 945.1 1103.4 534.2 y7 y5 846.3 [M+2H-H2O]+2 b7 b4o 662.2 954.2 y8 b12 y3 781.6 822.1 1016.4 b10o y13 1391.4 b2 447.1 b12o y14 b13 1174.4 1373.4 1561.4 b14 b15 348.1 276.9 429.0 1665.4 1355.3 1779.4 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

63 HPLC-ESI-MS Miscele complesse di peptidi non possono essere analizzate direttamente mediante spettrometria di massa. Tali miscele sono analizzate in maniera piu’ efficace tramite cromatografia liquida HPLC accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS). Un normale spettrometro di massa e’ capace di analizzare simultaneamente circa peptidi. Utilizzando LC-MS, le miscele peptidiche possono arrivare a contenere migliaia di componenti diversi.

64 HPLC-ESI-MS Fase mobile Colonna HPLC Campione ESI Spettrometro di
massa Campione

65 Analisi proteomica Lo studio qualitativo e quantitativo delle proteine contenute in un dato tessuto, coltura cellulare o fluido biologico. Tale studio puo’ riguardare rapporti quantitativi tra le proteine stesse, modificazioni post-traduzionali, interazioni tra proteine.

66 Analisi Proteomica Mediante nanoLC-ESI-MS/MS
DIgestione triptica Miscela di Proteine Miscela di peptidi nanoLC-ESI-MS/MS analysis 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 100 Relative Abundance RIcerca in banca dati Identificazione di centinaia/migliaia di sequenze peptidiche, riconducibili a centinaia di proteine diverse Migliaia di spettri MS/MS