La meccanica della mitosi.

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1 La meccanica della mitosi

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3 Cell cycle control: from models to molecules
Inhibitory kinase Remove inhibitory phosphate Inactive (weakly active) Active MPF (CDK1) CLB (cdc13) wee1 cdc2 CLB (cdc13) cdc2 CLB (cdc13) P cdc2 CLB (cdc13) P cdc2 P P P cdc25 CDK1 Inactive Phosphorylate M-phase substrates Histones Lamins MAPs etc Activating kinase Positive feedback ECB and 18-12 “MPF” contains two components: cdc2 gene product = catalytic subunit of protein kinase cyclin B (CLB = cdc13): regulatory subunit activates kinase MPF = “Cyclin-dependent kinase (CDK1)” cdc25 (inactive) MPF (CDK1) activity is also regulated by phosphorylation wee 1 is inhibitory kinase cdc25 is activating phosphatase “Switching on” CDK1 (MPF) drives cell into M-phase

4 Accumulation of cyclin B
MPF triggers its own inactivation “anaphase promoting complex (APC)”; targets cyclin B for degradation Metaphase (mid-M) High cyclin B MPF (CDK1) active Cyclin B accumulation activates MPF MPF activates APC APC inactivates MPF by degrading cyclin B A cytoplasmic oscillator Prophase (early-M) Activation of CDK1 by cyclin and cdc25 cdc2 CLB (cdc13) P Accumulation of cyclin B CLB (cdc13) APC Inactive Active cdc2 CLB (cdc13) P Polyubiquitin Interphase APC is turned off cdc2 Telophase (late-M) Low cyclin B MPF inactive Cyclin B degraded by proteosome Anaphase

5 Review: Interphase M-phase Time MPF activity ECB 18-6 MPF peaks in M-phase Cyclin synthesis Cyclin degraded Accumulation of cyclin B above threshold activates MPF (CDK1) and promotes entry into M-phase Activation of APC by MPF promotes cyclin destruction, MPF inactivation, and exit from M-phase

6 Multiple CDKs regulate progression through the cell cycle
Trigger M-phase At least 6 different CDKs and multiple cyclins in mammals Done M-phase M-phase cyclin degraded… P Active M-phase CDK (MPF) M-phase cyclins (B) G2 M G1-CDKs; drive cells through G1 (won’t discuss) G1 M-phase CDK (CDK1) S-phase CDKs S S-phase cyclins and CDKs regulate DNA replication S-phase cyclins degraded… S-phase cyclins Degradation of S-phase cyclins promotes exit from S-phase into G2 P Active S-phase CDKs ECB 18-13 Trigger S-phase

7 S-Cdk regulates DNA replication
Origin recognition complex - protein scaffolding for assembly of other proteins Cdc6 increases in G1; binds ORC and induces binding of other proteins forming pre-replicative complex Origin is ready to fire ECB 18-14 18_14_S_Cdk.jpg Active S-Cdk 1- phosphorylates ORC causing origin to fire = replication 2-phosphorylates Cdc6 leading to ubiquitination and degradation Cdc6 not made until next G1 - prevents origin from double firing

8 Completion of critical cellular processes is monitored at cell cycle “check points”
ECB 18-17 Is the cell big enough? Is the environment favorable? Is DNA undamaged? Yes? Enter S phase Is DNA undamaged? Is DNA replicated? Is cell big enough? Yes? Enter M phase Have all chromosomes attached to spindle? Yes? Proceed to anaphase Of these, the G1/S checkpoint for damaged DNA is best understood

9 inactivates S-phase CDK
The DNA damage checkpoint: p53 induced expression of an S-phase CDK inhibitor p53 (inactive) DNA damage activates p53 Active p53 acts as a transcription factor to turn on genes, including p21 p21 protein inhibits G1/S phase CDKs, blocking entry into S-phase Cell arrests in G1 until damage repaired, or undergoes apoptosis (programmed cell death) RNA pol p53 (active) DNA p21 gene Transcription Translation p21 ECB 18-15 P P P21 binds and inactivates S-phase CDK Active S-phase CDK

10 The mechanism of regulation of the entry into mitosis at the G2/M checkpoint involves the active form of the protein MPF (cyclin B/Cdk1 complex phosphorylated at one amino acid, dephosphorylated at two other amino acids). (MPF stands for "maturation promoting factor.") This is related to the continual synthesis of cyclin, its degradation, a kinase that phosphorylates Cdk1, and a phosphatase that dephosphorylates Cdk1. DNA damage activates a separate kinase that results in deactivation of MPF. Examples of Cdk1/Cyclin B's Action: Condensins (protein complexes that are responsible for chromosome condensation during mitosis and meiosis) are activated by Cdk1/cyclin B phosphorylation. Also, the breakdown of the nuclear envelope that occurs at the outset of prophase (or prophase I). The membrane breakdown involves the phosphorylation of lamins by Cdk1/cyclin B, causing their depolymerization.

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13 Synthesis and Degradation of Cyclin correlates with MPF Activity

14 Centrosomes (with centriole pairs) Early mitotic spindle Centrosome
INTERPHASE PROPHASE Centrosomes (with centriole pairs) Early mitotic spindle Centrosome Fragments of nuclear envelope Kinetochore Chromatin Centrosome Spindle microtubules Nucleolus Nuclear envelope Plasma membrane Chromosome, consisting of two sister chromatids Figure 8.6

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16 TELOPHASE AND CYTOKINESIS
METAPHASE ANAPHASE TELOPHASE AND CYTOKINESIS Cleavage furrow Nucleolus forming Metaphase plate Nuclear envelope forming Spindle Daughter chromosomes Figure 8.6 (continued)

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20 Gli Attori: Una cellula Cromosomi Il fuso mitotico: Microtubuli… ma non solo Motori proteici e altro ancora

21 Anatomia di un cromosoma

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23 Chromosome maintenance
Origins of replication Telomeres Centromeres

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25 Problema n°1 replicare e compattare ma non separare

26 COHESIN Fino alla separazione i cromatidi fratelli sono tenuti saldamente insieme Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

27 Le porzioni di DNA più ricche di GpC si duplicano per ultime
Figure (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

28 Soluzione:

29 soluzione Le condensine e le coesine Le condensine e le coesine hanno struttura e funzione correlate: Entrambe le proteine hanno domini di legame all’DNA e all’ATP identici ad un’estremità e una regione di cerniera nell’altra, collegate da due regioni lunghe e a “coiled-coil”. Questa struttura flessibile è ben adatta per il loro ruolo come molecole che formano legami incrociati con il DNA.

30 Le coesine formano legami incrociati tra due cromatidi fratelli, incollandoli insieme.
Le condensine mediano legami incrociati intramolecolari per creare delle anse nel DNA nel processo di condensazione dei cromosomi. SMC (structural maintenance of chromosome) Le SMC hanno domini ATPasici

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32 Coesione inizia in fase-S
Pds5 Scc3 Scc1 Smc1 Smc3 Cohesin Condensin From Uhlman (2001) Cur. Op. Cell Biol. 13:754

33 Scissile Subunit (Scc1)
Coesione inizia in fase-S Cohesin Condensin Chromosome Cohesion Chromosome Compaction Scissile Subunit (Scc1) Cleaved at M/A From Uhlman (2001) Cur. Op. Cell Biol. 13:754

34 Cohesion is Established in S-phase
Cdc6 ORC MCM Proteins Cdc28 Cdc7 Replication Factors Origin Assembly / Activation preRC Origin Firing Origin Inactivation Elongating Repl. Fork Actvie Cohesin From Susan Forsburg, Salk Institute

35 Le condensine Condensins cause chromatin to be more tightly coiled by introducing positive supercoils into DNA. Condensins are responsible for condensing chromosomes at mitosis. Chromosome-specific condensins are responsible for condensing inactive X chromosomes in C. elegans. La fosforilazione delle condensine è uno dei fattori che determinano la condensazione della cromatina

36 Condensin is Required for
Chromosome Compaction Cohesin is Required for Chromosome Compaction

37 Cohesin links Condensin from adjacent sister chromatids
Condensin is Required for Chromosome Compaction Cohesin is Required for Chromosome Compaction Cohesin links Condensin from adjacent sister chromatids

38 Le code amino terminali degli istoni
del core nucleosomale sono essenziali per la condensazione cromosomica • H1 e’ substrato di ciclina B/ Cdk1, tuttavia la condensazione cromosomica in estratti mitotici di Xenopus avviene anche senza H1 • La coda N-terminale dell’istone H3 e’ essenziale per la condensazione mitotica

39 Il centromero Il centromero (o regione CEN) è una regione specifica del cromosoma eucariotico. Storicamente è definito come "costrizione primaria del cromosoma" in quanto corrisponde alla regione in cui il cromosoma condensato (chiamato anche mitotico) risulta più sottile, assomigliando a una sorta di strozzatura decentrata.

40 Il centromero rappresenta una struttura altamente differenziata del cromosoma costituito da DNA e proteine. E’ una struttura indispensabile del cromosoma eucariotico che consente di tenere uniti i due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma fino alla metafase e consente altresì una corretta separazione dei due cromatidi fratelli all’anafase. Per potere funzionare in modo corretto, ogni cromosoma deve possedere un solo centromero: cromosomi senza centromero o con due centromeri (dicentrici) si ripartiscono in modo anomalo durante la mitosi determinando la formazione di cellule figlie con corredo genico non bilanciato.

41 Modello di organizzazione del centromero
La formazione del centromero è un processo complesso che consiste nell’organizzazione del DNA in cromatina centromerica tipica la quale si associa con proteine specifiche. Tre osservazioni suggeriscono che per la formazione dei centromeri non sono indispensabili sequenze specifiche ma che il meccanismo implicato è strettamente correlato a modificazioni epigenetiche: • la sequenza ripetuta centromerica presente negli eucarioti superiori non è conservata in insetti, funghi, piante e neanche nei mammiferi; • cromosomi isodicentrici, sebbene hanno due blocchi di sequenze alfa satelliti hanno un solo centromero attivo; la scoperta di neocentromeri analfoidi in Drosophila e nell’uomo ha confermato che cinetocori funzionali possono essere assemblati in una grande varietà di sequenze genomiche.

42 Sebbene, verosimilmente, qualsiasi sequenza di DNA può formare un centromero, è poco chiaro in che modo una sequenza può determinare la centromerizzazione. E’ possibile, comunque, che alcune strutture primarie possano più di altre determinare strutture secondarie e terziarie che costituirebbero lo scaffold del centromero. Numerosi meccanismi epigenetici noti sembrano essere coinvolti direttamente nella formazione del centromero modificando la struttura della cromatina. Tra tali meccanismi epigenetici ricordiamo: • la metilazione dell’eterocromatina pericentromerica ricca di CpG; • la deacetilazione degli istoni H3 e H4 nelle regione centromeriche e pericentromeriche; • fosforilazione degli istoni H1 e H3 cionvolta nella compattazione della cromatina; • i cambiamenti conformazionali di livello superiore della cromatina determinati dal legame tra il DNA centromerico e proteine centromeriche specifiche quali per esempioCENP-A, CENP-C.

43 Le proteine costitutive del centromero
Le proteine coinvolte nella funzionalità del centromero sono numerose e possono essere suddivise in due categorie: le proteine costitutive del centromero e le proteine accessorie del centromero. Tra le prime vi è un piccolo gruppo di proteine centromeriche molto importanti in quanto necessarie al corretto assemblaggio del cinetocore. Queste proteine, che sono associate alcentromero per tutta la durata del ciclo cellulare, si assemblano in maniera gerarchica e codipendente permettendo sia la formazione del cinetocore che la determinazione epigenetica e quindi la funzione e la propagazione dei centromeri. Tali proteine sono: CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-H, CENP-I e Mis12. Dominio di appaiamento: INCEP Coesina CliP Piastra esterna: CENP-E CENP-F Dineina Mad’s Bub’s Dominio centrale CENP-B DNA α-satellit Piastra interna: DNA α-satellite CENP-C CENP-A CENP-G CENP-H CENP-I Mis12

44 Il dominio centrale La cromatina centromerica può essere suddivisa in due parti: la “cromatina centrica” e la “cromatina pericentrica”. La distinzione è basata sulla presenza/assenza della proteina centromerica CENP-A. Tale proteina, che è una variante dell’istone H3, determina la formazione di nucleosomi con caratteristiche peculiari. Infatti, la cromatina centrica, è presente nel sito in cui si assembla il cinetocore, ed è costituita da nucleosomi contenenti CENP-A alternati ad altri che presentano l’istone H3, mentre la cromatina pericentrica ha solo nucleosomi normali, cioé contenenti l’istone H3, e forma la cosiddetta eterocromatina, importante per la stabilizzazione e l’integrità del centromero. Il DNA centromerico è costituito da ripetizioni in tandem di piccole sequenze organizzate testa-coda. Nell’uomo il monomero ripetuto di DNA centromerico è lungo 171 bp ed è conosciuto come alfa-satellite. L’alfa-satellite è il tipo di sequenza maggiormente rappresentato nelle regioni centromeriche dei cromosomi umani e mostra dimensioni variabili (da circa 200 Kb a più di 4 Mb). L’alfa-satellite umano presenta una specifica sequenza di 17 bp, detta CENP-B box, una sequenza che è riconosciuta dalla proteina centromerica CENP-B

45 Il dominio d’appaiamento
Il dominio d’appaiamento comprende la superficie interna del centromero, dove i cromatidi fratelli si appaiano mediante specifiche proteine, quale ad esempio la proteina INCENP (Inner CENtromere Protein). Il dominio di appaiamento ha l’importante funzione di tenere uniti i cromatidi fratelli dopo la replicazione del DNA, fino alla successiva metafase.

46 Secondo tale modello la cromatina della
regione di centromerizzazione presenta tratti contenenti nucleosomi con l’istone H3 alternati, in modo abbastanza regolare, con regioni contenenti nucleosomi con CENP-A (al posto di H3). Studi di immunoprecipitazione inoltre indicano che CENPC si localizza in corrispondenza dei nucleosomi contenenti CENP-A, quindi anche CENP-C occupa domini discontinui. Solo parte dei domini contenenti CENP-B colocalizza con CENP-A e CENP-C, suggerendo che CENP-B si lega alle CENP-Bbox sia nei domini di CENP-A che nei domini dell’istone H3. Come possiamo vedere osservando la figura, secondo tale modello, CENP-C è fondamentale per il legame con le fibre del fuso, ma non si lega direttamente ad esse, bensì con l’interposizione di altre proteine centromeriche. Infine, secondo tale modello nell’organizzazione del centromero, è fondamentale la conformazione spaziale (a forma di cilindro) che la cromatina assume determinata soprattutto da CENP-A e CENP-C.

47 Il dominio di appaiamento
Le Chromosomal Passenger Proteins (CP) sono un gruppo di proteine centromeriche accessorie, che si associano transitoriamente con il centromero. Esse sono implicate nella coesione tra cromatidi fratelli e nel coordinamento degli eventi che coinvolgono i cromosomi e il citoscheletro durante la mitosi. Durante la profase le CP si accumulano lungo i cromosomi in via di condensazione e con il procedere della mitosi si concentrano nella parte interna del centromero. Successivamente si ritrovano nella parte interna della piastra metafasica per poi separarsi dai cromosomi quando questi segregano durante l’anafase; durante la citodieresi, le CP rimangono localizzate nella parte centrale del fuso mitotico. Attualmente sono note sei proteine CP: INCENP (Inner Centromeric Protein), Aurora-B, Survivina, Borealina, CSC-1 (Chromosome Segregation and Cytokinesis defective -1) e TD-60 (Telophase Disk - 60).

48 La differenza tra centromero e cinetocore
Sul centromero si assembla una struttura proteica chiamata cinetocore. Il cinetocore iteragisce con i microtubuli del fuso mitotico e permette la segregazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule figlie durante il processo di anafase I e II della meiosi o durante l'anafase mitotica, se ciò non accadesse si avrebbero dei seri danni alle future cellule. La differenza tra centromero e cinetocore il centromero è la porzione del cromosoma in cui i cromatidi fratelli sono tenuti strettamente legati il cinetocore è la struttura proteica costruita sul centromero su cui si attaccano i microtubuli delle fibre del fuso.

49 Il cinetocore: il sito d'attacco per i microtubuli del fuso mitotico

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51 COME E’ FATTO UN CINETOCORE?
I cinetocori sono posizionati ai lati opposti della costrizione primaria, sulla faccia esterna del cromosoma. Al microscopio elettronico presentano una struttura a forma di disco trilaminare: due parti, la piastra esterna e quella interna, sono elettrondense, tra di loro si trova la terza parte, più chiara, di nm di spessore. La piastra interna è associata con la superfice dell'eterocromatina centromerica, mentre qualla esterna prende contatto con le fibre del fuso mitotico. Il cinetocore contiene proteine con funzione diversa. Alcune sono coinvolte nell’attività motoria e fondamentali per l’organizzazione strutturale come le proteine CENP (CENtromere Protein), mentre altre sono implicate nella regolazione della transizione metafaseanafase

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55 Il complesso centromero-cinetocore è capace di svolgere funzioni essenziali in differenti aspetti della mitosi e della meiosi: -è responsabile dell’appaiamento dei cromatidi fratelli, -rappresenta il sito d'attacco per i microtubuli del fuso mitotico, -controlla la transizione metafase-anafase nel ciclo cellulare regolando il movimento dei cromosomi.

56 Il corretto orientamento dei cromatidi fratelli e la segregazione degli stessi durante l'anafase sono determinati dal legame dell’estremità positiva (plus-end) dei microtubuli del fuso mitotico, provenienti dai poli opposti della cellula, alla piastra esterna del cinetocore (che contiene proteine importanti per il movimento dei cromosomi quali CENP-E e la dineina). In genere i cinetocori sono in grado di legare dai 10 ai 45 microtubuli.

57 A CHE SERVE IL FUSO MITOTICO? COME SI FORMA? COME FUNZIONA?
COME SI ALLINEANO I CENTROSOMI? COME SI SEPARANO I CENTROSOMI? COME I MICROTUBULI SI LEGANO AI CROMOSOMI? COME VENGONO ‘AGGANCIATI’ I CROMOSOMI? COME SI MUOVONO I CROMOSOMI? COME SI SEPARANO I CROMATIDI?

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59 Schematic representation of the metaphase spindle.
Gay G et al. J Cell Biol doi: /jcb Schematic representation of the metaphase spindle. (A) In vivo. (left) The two SPBs are linked by overlapping interdigitated microtubules (MT). The chromosome (gray) is linked to the SPBs by its centromere regions. The four microtubule attachment sites located on each kinetochore (Kt) are connected to the SPBs by ktMTs. The two sister chromatids are held together by the cohesin complex. (right) Schematic depiction illustrating the in vivo structure of the ktMT attachment site. Several motors are present at the ktMT interface. (B) In silico. (top) The SPBs are linked by the interdigitated microtubule force generator. Each microtubule attachment site on the kinetochore is linked to the SPB through a ktMT (blue). The four microtubule binding sites (purple) are associated to the chromosomes by the centromere and represented by a spring and a dashpot (purple). Cohesin between the sister chromatids is modeled as a single spring linking both centromeres. (bottom) Schematic depiction illustrating the different forces applied in silico at the centromere level (left), the microtubule attachment site (middle), and at the SPB (right). (C) A simple stochastic process of microtubule attachment and detachment reproduces the directional instability. At any time, microtubule attachment sites (purple) attach with the frequency ka (left, force is on) or detach with the frequency kd (right, force is off). This attachment/detachment process leads to an imbalance of the forces applied on the chromosome and to chromosome dynamics within the spindle (also see Video 1). © 2012 Gay et al.

60 REM NMR

61 I motori proteici chinesine del fuso CENP-E, ncd, BimC

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