ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

Presentazione sul tema: "ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE"— Transcript della presentazione:

1 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
Identificate negli anni ‘70 Enzimi che tagliano il DNA in maniera sequenza-specifica Sistema di riconoscimento di DNA estraneo dei batteri - sistema “immunitario” batterico

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3 Esempi di sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione

4 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA

5 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA

6 TAGLIO DEL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
Riconoscimento della sequenza Taglio asimmetrico - estremità coesive Taglio centrale estremità “blunt”

7 TAGLIO DI DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
Produzione di frammenti di dimensioni diverse Frammenti estremamente numerosi

8 PERCHE’ TAGLIARE IL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
Ogni gene può essere presente in uno o più frammenti di DNA Mediante l’analisi dei frammenti specifici è possibile identificare alterazioni a carico di DNA cause di malattie genetiche

9 TIPI DI ALTERAZIONI CHE DANNO ALTERAZIONI DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE
Assenza di un frammento Delezioni di un pezzo di DNA Alterazioni di dimensioni di un frammento Duplicazioni di un pezzo di DNA Comparsa o scomparsa di un nuovo frammento Traslocazioni, mutazioni che causano la comparsa /scomparsa di un sito di restrizione

10 COME ANALIZZARE IL DNA TAGLIATO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
Separazione dei frammenti Gel di agarosio Trasferimento dei frammenti su un supporto più maneggevole Southern blot Ibridizzazione con sonde specifiche Autoradiografia

11 Gel di agarosio E’ un polimero lineare
La visualizzazione avviene grazie alla colorazione con etidio bromuro Tale colorante contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi del DNA dando origine ad un legame che aumenta la quantità di fluorescenza se confrontato con quello libero La distanza della banda rispetto al punto di deposizione sul gel è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento amplificato

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13 Gel Electrophoresis

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16 SOUTHERN BLOT Inventato all’inizio degli anni ‘80 da Ed Southern
Trasferimento del DNA separato elettroforeticamente su un supporto solido (nylon, nitrocellulosa) mediante capillarità

17 SOUTHERN BLOT

18 SOUTHERN BLOT Parametri importanti
Tampone deve passare attraverso il gel e non lateralmente (corto-circuito) Forza ionica adeguata Supporto e carta pre-trattati Assenza di bolle d’aria Legame del DNA al filtro mediante UV o “baking”

19 SOUTHERN BLOT

20 STRINGENZA

21 IBRIDIZZAZIONE Parametri importanti
Probe Privo di sequenze ripetute Privo di sequenze omologhe (pseudogeni) Stringenza dell’ibridizzazione Temperatura Forza ionica nel buffer di ibridizzazione Forza ionica nei buffer di lavaggio

22 SOUTHERN BLOT

23 ESPOSIZIONE Parametri importanti
Perfetta adesione del filtro alla lastra Assenza di residui di tampone sul filtro Durata dell’esposizione Uso di Phosphorimager

24 SOUTHERN BLOT Analisi di delezione

25 SOUTHERN BLOT Analisi di espansione

26 Amplification Fragment Length Polymorphisms Restriction digestion
(AmpFLPs) (1) Normal DNA (2) Mutant DNA PCR Product Restriction digestion analysis 1 2 3 SM

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