Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol

Presentazione sul tema: "Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol"— Transcript della presentazione:

1 Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol

2 Membrana Nucleare >Due membrane concentriche          Membrana –esterna in continuità con ER          Membrana interna contiene proteine che agiscono come           siti di legame per la cromatina e lamina nucleare >Perforata da pori nucleari per     importazione ed esportazione selettiva

3 La lamina nucleare sta alla base della membrana nucleare
La lamina nucleare è costituita da proteine filamenti intermedi chiamate lamine. La lamina nucleare si trova sotto la membrana nucleare interna e Esse sono fisicamente collegati da proteine integrali di membrana a cui si lega la lamina La lamina nucleare fornisce supporto fisico per l'involucro nucleare.

4 La lamina nucleare gioca un ruolo chiave nell’assemblaggio e disassemblaggio della membrana nucleare in mitosi Lamina La lamina perde la capacità di strutturarsi quando viene fosforilata.

5 Proteine della INM Sono coinvolte nell’organizzazione della cromatina nel nucleo Proteine dell’ONM In continuità anche con proteine INM colelgano il nucleo al citoscheletro

6 The Nuclear Pore Complex
NPC: all traffic between nucleus & cytoplasm in higher eukaryotes occurs via NPC (exception: mitosis) Cytoplasmic filament Ribosome ~150Å ~2000Å Cytoplasmic ring Cytoplasm Nucleus Inner ring Basket Distal ring

7 Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol
Complesso del poro nucleare >massa di 125 milioni KD; >~ 50 proteine diverse disposti in ottagono >Tipico cellule di mammifero

8 Residui fenilalanina-glicina giocano un ruolo chiave nel trasporto nucleare

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10 Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol
Attraverso il canale acquoso del poro possono facilmente passare piccole molecole<5.000; Molecole> non passano Funzioni ~ diaframma Proteine recettori trasportano attivamente Molecole attraverso poro nucleare

11 Nuclear Localization Signal Generalmente composto da due brevi sequenze ricche di + aa lys & arg Può essere posizionato ovunque Pensato per formare loop o macchie sulla superficie proteica Gli NLS non vengono rimossi dopo il trasporto Trasporti attraverso pori acquosi non proteine translocatori Trasportano proteine ripiegate Il processo richiede energia

12 LA NUCLEOPLASMINA E’ UNA PROTEINA CHE SI LOCALIZZA NEL NUCLEO
 NUCLEOPLASMINA RADIOATTIVA  INIEZIONE NEL CITOPLASMA  LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO

13 LE TESTE DELLA NUCLEOPLASMINA NON SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO
RADIOATTIVE  INIEZIONE NEL CITOPLASMA LOCALIZZAZIONE NEL CITOPLASMA

14 LE CODE DELLA NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO
 LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO CODE RADIOATTIVE INIEZIONE NEL CITOPLASMA LE CODE DELLA NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO

15 PARTICELLE DI ORO COLLOIDALE LEGATE ALLE CODE DI NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO
CODE LEGATE AD ORO COLLOIDALE  INIEZIONE NEL CITOPLASMA   LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO

16 LA SEQUENZA SEGNALE DELL’ANTIGENE T E’ STATA INDIVIDUATA MEDIANTE DELEZIONI
N/C C N C

17 LA LISINA IN POSIZIONE 128 HA UN RUOLO CRITICO NELLA LOCALIZZAZIONE NUCLEARE DELL’ANTIGENE T
SI LOCALIZZA NEL NUCLEO

18 LA DIMOSTRAZIONE CHE UNA SEQUENZA E’ UN
SEGNALE PREVEDE ESPERIMENTI DI: 1. RIMOZIONE DELLA SEQUENZA 2. MUTAZIONE DELLA SEQUENZA 3. TRASFERIMENTO DELLA SEQUENZA SU UN’ALTRA PROTEINA

19 LE SEQUENZE SEGNALE DI LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO HANNO CARATTERISTICHE IN COMUNE
PROTEINA ANTIGENE T (SV40) PROTEINA 72kDa (adenovirus) VP2/3 (polioma) 70kDa (drosophila) c-myc (pollo) SEQUENZA Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg Gln-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu Lys-Arg-Gly-Lys-Arg-Lys-Lys Glu-Gln-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg

20 NUCLEAR LOCALIZATION SIGNALS
LE SEQUENZE SEGNALE DI LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO HANNO CARATTERISTICHE IN COMUNE NLS NUCLEAR LOCALIZATION SIGNALS 1. SEQUENZE RICCHE IN AA BASICI PKKKRKV 2. ALL’INTERNO DELLA PROTEINA! 3. FREQUENTEMENTE BIPARTITE!!

21 The molecular machineries behind nuclear protein transport
Nucleoporins (known as Nups): Make up the cytoplasmic filaments, nuclear basket, and line the pore Contain different types of FG (Phe/Gly) repeats Nuclear transport factors make multiple sequential contacts with distinct Nups, resulting in docking and translocation of nuclear transport complexes Exact mechanism by which Nups mediate translocation of complexes remains unclear. but may involve sequential association with of receptor plus cargo with FG repeats lining pore (Bayliss, R. et al )

22 Importo Nucleare - i giocatori
Importine = proteina recettore citosolico lega a NLS di proteine "cargo" Nuclear Import Recettori = lega macromolecole essere esportati da nucleo Adattatori = talvolta necessarie a legare proteina bersaglio al recettore nucleare RAN-GTP

23 LA PROTEINA RAN E’ UN REGOLATORE CHIAVE DEL TRASPORTO DI PROTEINE NEL NUCLEO
RAN GTP GAP GEF GTP hydrolysis activating protein guanine nucleotide exchange factor RAN GDP Nel citosol

24 Ran GTPase= molecular switch
Drives directional transport in appropriate directin Conversion btwn GTP and GDP bound states mediated by Ran specific regulatory proteins GAP converts RNA-GTP to Ran-GDP via GTP hydrolysis GEF promotes exchg of GDP for GTP converting Ran-GDP to Ran-GTP Ran GAP in cytosol thus more Ran-GDP in cytosol Ran GEF in nucleus thus more Ran-GTP in nucleus

25 5.15 The Ran GTPase controls the direction of nuclear transport
The Ran-GAP is cytoplasmic, whereas the Ran-GEF is located in the nucleus. Ran controls nuclear transport by binding karyopherins and affecting their ability to bind their cargoes.

26 RanGTP/GDP exchange: driving force behind cargo exchange
A small GTPase that gives directionality to nuclear transport, see below Members of the Ras oncogene family (like Rab, which regulates vesicle fusion) Binds to nuclear transport receptors (Matsurra and Stewart, 2004)

27 How does the Ran GTPase cycle work?
Ran GTPase has little hydrolysis or exchange activity on its own. Regulated by GTPase-activating protein (RanGAP) that promotes hydrolysis that is predominantly in cytoplasm and guanine exchange factor (RanGEF) that promotes GTP exchange that is predominantly in the nucleus Ran exists in inactive GDP-bound form in the cytoplasm In the nucleus, however, Ran is largely bound to GTP Ran gradient is critical for most nuclear transport, except bulk mRNA transport which is mediated by factors that are not karyopherins Ran gradient is created by having RanGAP (which promotes GTP hydrolysis) only in cytoplasm and RanGEF (which promotes loading of Ran with GTP) only in nucleus (Nalkieny and Dreyfus, 1999)

28 SI POSSONO INDIVIDUARE PIU’ TAPPE NEL TRASPORTO NUCLEARE
1. PROTEINE SOLUBILI (IMPORTINE) RICONOSCONO LE NLS 2. IL COMPLESSO IMPORTINE-PROTEINA NUCLEARE SI LEGA ALLE PROTEINE DEL PORO (NUP) (RIPETIZIONI FG) 3. IL PORO SI DILATA ED IL COMPLESSO LO ATTRAVERSA 4. L’IMPORTINA SI DISSOCIA DALLA PROTEINA NUCLEARE 5. L’IMPORTINA TORNA NEL CITOSOL

29 The nuclear import/export cycle
1. In the cytoplasm, NLS-containing cargo is bound by the heterodimeric import receptor (importin / (Lei and Silver, 2004)

30 The nuclear import/export cycle
2. Ran-GTP binds to importin, causing conformational change in the importin, which releases the cargo (Lei and Silver, 2004)

31 The nuclear import/export cycle
3. If cargo is phosphorylated, it can interact with exportins and Ran-GTP, allowing the complex to exit the nucleus (Lei and Silver, 2004)

32 The nuclear import/export cycle
3. In the cytoplasm, hydrolysis of Ran-GTP to Ran-GDP causes dissociation of the export complex (Lei and Silver, 2004)

33 Nuclear Export Works like import in reverse Export receptors bind export signals and nucleoporins to guide cargo thru pore Import and export receptors member of same gene family

34 Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol
Regulation Afforded by Access to Transport Machinery Controlling rates of import and export determines steady state location phosphorylation/dephosphorylation of adjacent aa may be required for receptor binding Cytosolic anchor or mask proteins block interaction w/ receptors Protein made and stored in inactive form as ER transmembrane protein

35 LE SEQUENZE SEGNALE POSSONO ESSERE MASCHERATE

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37 Control of mRNA Export Proteins w/ export signals loaded onto RNA during transcription and processing (RNP) Export signals guide RNA out of nucleus thru pores via exportin proteins than bind RNP Export mediated by transient binding to FG repeats Immature mRNAs retained by anchoring to transcription and splicing machinery Proteins disassociate in cytosol and return to nucleus

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39 Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol
Nuclear envelop disassembles during mitosis and reassembles when ER wraps around chromosomes and begins to Fuse