Ereditarietà X-Linked

Presentazione sul tema: "Ereditarietà X-Linked"— Transcript della presentazione:

1 Ereditarietà X-Linked
Madre Padre X X X Y Figlia Figlio

2 Cromosoma X Cromosoma Y
Regione pseudo-autosomica Geni sottoposti ad inattivazione Geni attivi X Inactive SpecificTranscript Xq13 circa 80 geni SRY Geni della spermatogenesi circa 870 geni

3

4 Cromosoma Y Delezioni interstiziali dell’Y nel 5-10% dei soggetti con
azoospermia o grave oligospermia non ostruttiva

5 Delezioni del cromosoma Y
Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione fornisce un corretto inquadramento diagnostico permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le tecniche di riproduzione assistita almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi

6 Casi di azoospermia o oligospermia severa :
il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y il 5-10% è portatore di delezioni sub-microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR STS “sequence tagged sites” sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR

7 Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001)
Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions M.Simoni et al. elenco di STS da non utilizzare set di STS primers consigliati: AZFa: sY84,sY86 AZFb: sY127,sY134 AZFc: sY254,sY255 Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)

8 Multiplex a sY254 (c) sY 86 (a) sY127 (b)

9 Multiplex b sY84 (a) sY134 (b) sY255 (c)

10 Frequenza delle microdelezioni Y
estema variabilità tra i vari studi (1%-55%) dipende dai criteri di selezione pazienti azoospermici o gravemente oligospermici (<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11% (solo le forme idiopatiche : 18%) se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1% Casistica laboratorio Genetica Medica: 1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c 2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)

11 AZFa AZFb AZFc DBY - UTY rara USP9Y* RBMY1A DAZ BPY2 CDY1 comune Del
interstiziale rara Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) AZFb RBMY1A (multicopia) Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi AZFc DAZ (4-7 copie) BPY2 CDY1 (2 copie una nel cluster DAZ una all’estremo 3’) interstiziale c comune Presenza di cellule germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile) terminale c intermedia interstiziale bc Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia terminale abc Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi

12 Variabilità fenotipica delle delezioni
non costante correlazione genotipo-fenotipo in genere: azoospermia (84%) grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%) moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%) alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY del Y molto centromeriche associate a bassa statura

13 Sex reversal

14 Inattivazione dell’X solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine
meno di 100 cellule propagazione clonale Zigote femminile casuale innattivazione X pat. / X mat. stadio di morula

15 Inattivazione bilanciata dell’X Cosa succede se una donna porta un gene non funzionante sull’X
gene mutato Zigote femminile Innattivazione casuale X paterno / X materno il 50% delle cellule non esprime quel gene

16 Inattivazione dell’X Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine Alcuni geni sfuggono all’inattivazione (regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X) I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione

17 Inattivazione sbilanciata dell’X Perchè ?
Un cromosoma X porta una mutazione LETALE C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma La regione che controlla l’inattivazione è alterata E’ avvenuto “per caso”

18 Inattivazione Sbilanciata dell’X: effetto della selezione
gene mutato Zigote femminile Selezione nei tessuti in cui la funzione del gene è indispensabile Inattivazione casuale stadio embrionale

19 Malattie X-Linked recessive
Madre ( portatrice ) Padre X X X Y Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO

20 Ereditarietà X-Linked recessiva

21 Ereditarietà X-Linked recessiva

22 Distrofia Musculare di Duchenne DMD
Giorgio Ester Enrico

23 Giorgio ha 3 anni modesto ritardo nell’iniziare a camminare
cammina con lentezza ha difficoltà a stare eretto non corre all’esame obiettivo ipertrofia dei gastrocnemi debolezza dei muscoli prossimali Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui

24 Biopsia Muscolare Controllo Normale Giorgio

25 Colorazione Ab anti-Distrofina
Controllo Normale Giorgio

26 Distrofina proteina associata alla membrana :
- il dominio N-terminale lega l’actina - lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica - una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio - il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana

27 Gene DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 8 promotori 79 esoni (0.6%)
mRNA 14 kb trascritto in 16 ore DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%) - mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%) - delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine) DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni “in-frame” (85%) - di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”

28 Ricerca diretta delle delezioni nella DMD
- preparazione del DNA genomico - amplificazione con PCR multiplex di 9 o più esoni separazione dei frammenti in gel di agarosio visualizzazione con EB e raggi UV - fotografia (o immagine digitale)

29 Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne
Diagnosi confermata da biopsia muscolare Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati ) Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300 tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)

30 Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna
Elena Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa

31 La cugina Rosa vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato
Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è = 25% Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?

32 Creatina Kinasi (CPK) fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato
molto elevata nei maschi malati livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici Giovanna e Rosa hanno CPK normale

33 Stima “Bayesiana” del rischio
Probabilità “complessiva “ : tiene conto della probabilita a priori di essere e di non essere portatore ( appartenendo ad dato albero famigliare ) e di altri fattori che modificano queste due probabilità (prob. condizionali)

34 Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi sani
Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale Giovanna Elena

35 Quale è la probabilità che Zia Giovanna sia portatrice ?
Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1 / / 2 con CPK Normale ? 1 / 3 1 con 2 figli Maschi Sani ? 1 / 4 1 Prob. condizionale 1/2 .1/3 .1/4 = 1 / / 2 Prob. finale : 1 / 24 1 / / 2 = 1 / 13

36 Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale
Elena Giovanna CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale

37 Il rischio a priori per Rosa è la metà di quello di Zia Giovanna
1/13 x 1/2 = 1/26

38 Quale è la probabilità che Rosa sia portatrice ?
Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / / 26 con CPK Normale ? 1 / Prob. “ a posteriori ” /26 .1/3 = 1 / / 26 Prob. finale : Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / / 26 con CPK Normale ? 1 / Prob. “ a posteriori ” /26 .1/3 = 1 / / 26 Prob. finale : 1 / 78 1 / /26 = 1 / 76

39 Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto
Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione 1/ 76 x 1/4 = / 304

40 1/304 è la probabilità che la cugina Rosa possa avere un figlio affetto
Elena Giovanna CPK normale (1/13) Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale (1/76)

41 Uso del Linkage nella malattia DMD ( mutazione non trovata )
Elena Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa

42 Analisi di linkage Linkage = concatenazione
Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi Allele 2 Gene wt Allele 1 Allele locus polimorfico A (1, 2, 3, 4) Gene con mutazione Allele locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)

43 Analisi di linkage La frequenza di ricombinazione
2 wt 1 1 Mut 3 La frequenza di ricombinazione è una “misura della distanza” tra loci diversi : = 0.5 (50%) loci lontani = 0 (0%) loci vicinissimi = 0.02 (2%) loci vicini unità di misura = centiMorgan cM = 1 ricombinazione/100 meiosi 1 wt 2 Mut 3

44 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan)
3’ Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, alleli Microsatellite C G E N E DMD Microsatellite B Esone 1 Microsatellite A: 1, 2, 3, alleli 5’

45 Uso del Linkage: 1 marcatore (A) 5’ UT
( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena 1 7 3

46 Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena 1 7 3 4 5 6

47 Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ? Elena Giovanna 2 5 4 6 5 4 9 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 2 4 4 5 6 9 7 1 7 3

48 1 e 2 ricombinazioni tra marcatori
mut 1 mut 1 mut 1 2

49 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan)
3’ Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, alleli Microsatellite C 0.124 = 4 ricombinazioni in 1 su 5000 casi G E N E DMD Microsatellite B Esone 1 Microsatellite A: 1, 2, 3, alleli 5’

50 Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ??
Nuove mutazioni 10-4 / meiosi (1/3 dei casi) Elena Giovanna 5 4 6 5 4 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 1 4 4 5 6 1 7 3

51 Analisi del rischio in famiglie X-linked
Informazioni dall’albero famigliare Calcolo del rischio secondo Bayes Ricerca della mutazione (test diretto) Uso del linkage (test indiretto) Attenzione alle ricombinazioni ! ( usare più marcatori… meglio se intragenici )

52 Caso negativo per delezioni e duplicazioni DMD
5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 1 5’-5N3 introne 1 5’-7n4 introne 25 STR kb a valle dell’esone 44 STR kb a valle dell’esone 45 STR49 introne 49 DMD1-2c introne 56 DXS1214 introne 62 3’DYS MS esone 79

53 determinazione del sesso (SRY) informativa solo la trasmissione Xp
5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 1 5’-5N3 introne 1 5’-7n4 introne 25 STR kb a valle dell’esone 44 STR kb a valle dell’esone 45 STR49 introne 49 DMD1-2c introne 56 DXS1214 introne 62 3’DYS MS esone 79 In caso di gravidanza: villocentesi in 11ma set determinazione del sesso (SRY) informativa solo la trasmissione Xp

54 introne esone